Structural studies of PrPsc

Resumen

La elucidación de la estructura de la PrPSc sigue siendo uno de los mayores retos en la investigación sobre priones. Las bases moleculares de la biología de la proteína priónica (PrP), tal como el mecanismo molecular de replicación y agregación, la barrera de especie y la patogénesis de la neurodegeneración, no serán entendidos hasta que la estructura este resuelta. Dado que las técnicas de alta resolución como RMN o la cristalografía de rayos X no pueden ser usadas, han sido llevadas a cabo otras técnicas de baja resolución. La proteolisis limitada ha sido utilizada para identificar regiones flexibles dentro de los multímeros de la PrPSc. Sin embargo, la presencia de carbohidratos covalentemente unidos y del glicosilfosfatidilinositol (GPI) de anclaje a la membrana, hacen imposible el estudio a través de espectrometría de masas. Con la finalidad de vencer estas dificultades, se usó la PrPSc de ratones transgénicos que expresan la proteína priónica (PrP) sin el GPI de anclaje a la membrana. Estos animales, producen PrPSc que está desprovista del anclaje GPI y de los carbohidratos, que por lo tanto, permite la detección y la localización de regiones flexibles, susceptibles a la enzima proteinasa K (PK), mediante Western Plot y espectrometría de masas. Por primera vez, ha sido posible obtener un estudio de la estructura completa de la PrPSc, teniendo en cuenta su susceptibilidad a la proteolisis. Las muestras de PrPSc sin GPI fueron digeridas con PK, sometidas a electroforesis Tricina-SDS-PAGE e hibridadas con un anticuerpo específico C-terminal (R1). Siete bandas fueron detectadas mediante Western blot, con pesos moleculares de aproximadamente 17, 14.6, 13, 12, 10.2, 8 y 6.7 kDa. A continuación, los estudios de espectrometría de masas detectaron 13 péptidos diferentes, con un peso molecular exacto de: 17148, 16726, 16371, 13606, 13463, 12173, 12041, 11171, 9687, 9573, 8358, 7436 y 6274; lo que coincide bien con las bandas resistentes a PK, identificadas en el Western blot. Estos péptidos corresponden a moléculas cortadas en las posiciones 81, 85, 89, 116, 118, 133, 134, 141, 152, 153, 162, 169 o 179, respectivamente. Los primeros 9 péptidos (hasta la posición 153), coinciden con los puntos de corte previamente identificados en la PrPSc natural (Sajnani et al. (2008)). Por lo tanto, el mapa de susceptibilidad a PK, que engloba a las regiones 116-118, 133-134, 141, 152-153, 162, 169 y 179, sugiere que estas regiones corresponden a lazos y giros, mientras que los cortes en las posiciones 81, 85 y 89 señalan la frontera entre los dominios C-terminal estructurado y el N-terminal desestructurado de la PrPSc. Dada la proporción de hoja-ß, proporcionada por los estudios de FTIR, es lógico concluir que las zonas resistentes a la PK que están flanqueando estas regiones susceptibles, probablemente corresponden a hebras de hojas-ß. Además, un considerable tramo C-terminal de la PrPSc es muy resistente a PK y por lo tanto quizá está completamente constituido por hoja-ß. Al mismo tiempo, aprovechando la propiedad de la PrPSc de polimerizar en fibras amiloides, diferentes técnicas de microscopia electrónica, desde baja resolución hasta la reconstrucción tridimensional, fueron empleadas para estudiar la ultraestructura del prion. Para llevar acabo estos exhaustivos estudios, la proteína usada fue la PrPSc sin anclaje a la membrana, porque esta proteína ha permitido la mejora en el proceso de purificación, de modo que proporciona la muestra mas limpia y adecuada, sin perder las propiedades naturales de la PrPSc. Se ha encontrado que las fibras individuales tienen una anchura de 3-5 nm, un patrón helicoidal irregular y que están formadas por dos protofilamentos entrelazados, con una distancia no regular entre cada entrecruzamiento. La reconstrucción tridimensional de las imágenes bidimensionales de las fibras, obtenidas mediante criomicroscopía también muestran dos protofilamentos enroscándose, alrededor de un eje común. Además, existen unas densidades de 2-2,5 nm que se repiten a lo largo del eje, sugiriendo que cada una de estas repeticiones es un monómero de PrPSc apilado. Estas densidades axiales son también evidentes en los tomogramas de las fibras, reconstruidos mediante tomografía electrónica. Otra medida importante, es la presencia de una reflexión de 4,8 Å en la transformada rápida de Fourier (FFT), característica de una estructura ¿cross-ß¿. Una de las imágenes de alta resolución obtenidas durante la criomicroscopía, también muestra claramente la reflexión de 4,8 Å en la separación entre las repeticiones de hebras-ß que se apilan como si fuera una escalera. Todos los datos obtenidos durante esta investigación, sugieren que cada monómero de PrPSc debe de estar enrollado en un estructura ¿cross-ß¿, de modo que aproximadamente 144 residuos (~G89-S232) encajen dentro de una anchura de 3-5 nm, mientras se mantiene la elevada proporción de hoja-ß. Por lo tanto, los monómeros de PrPSc deben necesariamente adoptar una arquitectura de multicapas; específicamente los resultados encajan perfectamente con las arquitectura de cuatro peldaños de hebras-ß, propuesto por Wille H et al. (2009), basado en sus interpretaciones de los patrones de difracción de rayos X. Por consiguiente, cada peldaño de monómero de PrPSc sin GPI estaría constituido por ~36-37 residuos. En resumen, los resultados apoyan la noción de que la estructura de la PrPSc consiste en un solenoide de cuatro peldaños, con un núcleo central rico en hebras-ß; donde las hebras de hoja-ß muy resistente a PK, están intercaladas con cortos y flexible lazos y giros, sensibles a PK. Además, la región que comprende ~V179 hasta la posición mas C-terminal de la PrPSc está probablemente compuesta de hoja-ß, debido a su elevada resistencia a la digestión con PK. Los datos obtenidos a partir de esta PrPSc desprovista del GPI son consecuentes con el anterior estudio de Sajnani et al. (2008), donde PrPSc de hámster fue estudiada (cepas 263K y Dy). Además, los resultados son concordantes con los observados en la PrPSc de CJD, lo cual sugiere que el gran número de priones de humano, hámster y ratón comparten una estructura básica común.