CpdB bacteriana y ADPRibasa-Mn humanaestudios de dos hidrolasas activas sobre nucleótidos cíclicos

Resumen

CpdB y ADPRibasa-Mn pertenecen a la superfamilia estructural �Metalofosfoesterasas�. Comparten estructura y actividad fosfodiesterasa sobre determinados nucleótidos cíclicos. CpdB. Durante la clonación y expresión heteróloga de una hidrolasa de c-di-AMP en Escherichia coli, dicha actividad apareció en una proteína del hospedador. C-di-AMP regula bacterias gram positivas. Hay poca información sobre gram negativas. Decidimos purificar e identificar la c-di-AMP fosfodiesterasa de E. coli. Su huella peptídica identificó a CpdB, conocida como fosfodiesterasa de nucleótidos 2´,3´-cíclicos y 3´-nucleotidasa. Por vez primera una �Metalofosfoesterasa� aparece entrelas fosfodiesterasas de dinucleótidos cíclicos. Fue clonada y caracterizada como enzima recombinante por primera vez. Se estudió su especificidad de sustrato e inhibición, y se investigaron las funciones de sus dominios (Ndom y Cdom), mediante su expresión separada y la mutación de dos aminácidos. His117 (Ndom) tiene función catalítica y Tyr544 (Cdom) une y reconoce sustrato o inhibidor. Finalmente se prepararon dos proteínas quiméricas con un dominio de Cpdb y otro de UshA, una 5´-nucleotidasa de E. coli. ADPRibasa-Mn. Hidroliza ADP-ribosa, CDP-alcoholes y ADP-ribosa cíclica (cADPR). Dentro de un estudio más amplio sobre bases moleculares de catálisis y especificidad, aquí se prepararon y caracterizaron dos mutantes de la ADPRibasa-Mn humana. His111 participa en el mecanismo catalítico, igual que en CpdB y otras �Metalofosfoesterasas�. Combinando tres mutaciones, se consiguió una ADPRibasa-Mn activa preferentemente sobre cADPR.