Purificación y caracterización bioquímica de poligalacturonasas inducidas en aspergillus Níger con pectina de cítrico

Résumé

El objetivo principal de este trabajo de investigación se centra en el diseño de un protocolo de purificación de las poligalacturonasas de Aspergillus niger CECT 2088, mediante el cual se obtengan niveles adecuados de rendimiento y un alto grado de purificación. Aspergillus niger sintetiza múltiples formas de poligalacturonasa, cuya expresión puede regularse por factores tales como el tipo de cepa utilizada, las condiciones de crecimiento microbiano y el inductor utilizado. Por este motivo, inicialmente se estudió la influencia del medio de proliferación del hongo en la producción de isoenzimas, estableciéndose como condiciones óptimas para la producción de actividad poligalacturonasa, el crecimiento del microorganismo en el medio Czapek-Dox y la posterior inducción con pectina de cítrico. Teniendo en cuenta que el extracto crudo donde se encuentran las enzimas a purificar es un medio fúngico extracelular, se planteó un proceso de purificación en el que se comenzó aplicando técnicas poco resolutivas que permitiesen concentrar la proteína en un mínimo volumen de trabajo, como la ultrafiltración y la precipitación fraccional con sulfato amónico. Posteriormente, se aplicaron técnicas de mayor resolución como la cromatografía de permeabilidad en gel y la cromatografía de intercambio iónico. El proceso incluía por tanto cuatro etapas de bajo coste económico y aplicables a gran escala. Como resultado del proceso global de purificación se obtuvieron cuatro fracciones con actividad poligalacturonasa, una de ellas, completamente purificada. Su posterior caracterización permitió obtener un mayor conocimiento de las isoenzimas y rentabilizar sus aplicaciones industriales. Así, los pesos moleculares de las cuatro poligalacturonasa aisladas fueron 73.811, 40.620, 59.030 y 59.470 Da. Además, todas ellas presentaban puntos isoeléctricos ácidos iguales o inferiores a 4,00 y mostraban diferente afinidad por el