Diagnóstico de las diátesis hemorrágicas hereditarias mediante el análisis genético por secuenciación masiva

Zusammenfassung

[ES] Las diátesis hemorrágicas hereditarias (DHH) constituyen un grupo amplio y heterogéneo de trastornos hereditarios y/o congénitos poco frecuentes, relacionados con la alteración en la hemostasia primaria y en la hemostasia secundaria. Como consecuencia, el paciente experimenta episodios de sangrado con distintos grados de gravedad. No es infrecuente encontrar pacientes con estas características en la práctica clínica habitual. La gran heterogeneidad de las DHH, principalmente en los trastornos plaquetarios hereditarios, proviene de que las alteraciones en diferentes genes pueden producir un fenotipo clínico similar para cada una de ellas. Para su correcto diagnóstico es preciso, en la actualidad, combinar varias metodologías, lo que requiere un esfuerzo considerable en tiempo y en dinero. A pesar de ello, en bastantes ocasiones no se llega a un diagnóstico de certeza. Cuando los síntomas de sangrado hacen sospechar la existencia de una DHH (especialmente en niños, pero también en adultos en los que la patología no se haya manifestado en la infancia), se aplica un algoritmo que consiste en la caracterización clínica, fenotípica y funcional o del laboratorio del paciente. Todos estos estudios son necesarios para poder dirigir el análisis molecular a un gen candidato y, así, poder confirmar el diagnóstico. Esta estrategia supone un reto diagnóstico debido a que, en bastantes ocasiones, el diagnóstico de estas enfermedades es difícil, sobre todo en los casos con fenotipos hemorrágicos leves o indeterminados. También requiere una gran cantidad de pruebas, una validación interna e interlaboratorial y la repetición del estudio para que desaparezcan posibles factores intercurrentes adquiridos. Por tanto, las principales limitaciones para la detección de las DHH son: a) La falta de acuerdo en su clasificación y en su estandarización; b) la presencia de fenotipos clínico-biológicos coincidentes y su gran heterogeneidad clínica y molecular; y c) la dificultad para incorporar las herramientas diagnósticas a la rutina diaria y su complejidad técnica. Así, por ejemplo, en los trastornos plaquetarios hereditarios (TPHs), la heterogeneidad clínica, el solapamiento de fenotipos o la dificultad para definirlo obstaculizan la búsqueda de mutaciones en un gen candidato y, por tanto, el diagnóstico molecular. Por ello, sólo es factible identificar el gen afectado en el 40-50% de los TPHs. Por otro lado, en los trastornos de la hemostasia secundaria, elgen candidato a estudio suele estar bien definido, aunque pueden existir deficiencias combinadas. Sin embargo, como ocurre en la enfermedad de von Willebrand (52 exones codificantes) o, principalmente en la hemofilia A (26 exones y 186 kb de tamaño), tras descartar las mutaciones recurrentes (inversión del intrón 22; intrón 1), la secuenciación de un gran número de exones supone otra dificultad en tiempo y coste. En estos casos, también, la secuenciación convencional sería un método inapropiado para la rutina clínica diaria. La carencia de métodos diagnósticos sencillos aplicados en la práctica clínica habitual, motiva que, en ocasiones, al clínico le resulte complicado, a veces imposible, emitir un diagnóstico certero. En consecuencia, existe el riesgo de la prescripción de tratamientos inapropiados que no solucionarán su patología, por lo que el paciente no mejorará y podrá tener efectos secundarios no deseados. Además, se multiplicarán los gastos inherentes a su tratamiento y a la identificación de la anomalía causante del trastorno, al tener que emplear métodos gravosos y complejos desde el punto de vista clínico y dilatados en el tiempo. Hasta hace poco tiempo, la búsqueda de información genética a gran escala aplicada al diagnóstico clínico era, desde el punto de vista técnico, compleja, y, desde el económico, poco viable. Sin embargo, en la actualidad se dispone de un nuevo conjunto de métodos de alto rendimiento denominados secuenciación masiva o Next- Generation Sequencing (NGS), que son herramientas valiosas tanto para la investigación como para la evaluación de trastornos clínicos causados por mutaciones genéticas. Estas plataformas de alto rendimiento, en sus distintas modalidades como paneles de genes customizados (targeted genes panel), exoma completo (Whole-Exome Sequencing) o incluso, el genoma completo (Whole-Genome Sequencing) tienen la capacidad de secuenciar gran cantidad de información genética de manera paralela, simultánea y de forma precisa para identificar las mutaciones causantes de las enfermedades de base genética. Esta tecnología ha evolucionado rápidamente durante la última década hasta el punto de constituir hoy una alternativa atractiva, tanto a nivel práctico como económico, con la que abordar el diagnóstico de patologías con alta complejidad. De este modo, en el momento actual es razonable plantearse el uso de la NGS tanto para explorar cambios en todos los genes que con alta probabilidad pueden causar un fenotipo clínico y de laboratorio concreto, como para buscar la causa no conocida de patologías plaquetarias de fenotipo inespecífico que son, por otra parte, las más comunes y difícilmente abordables. Además, como bien es conocido, si los fenotipos de estas entidades pueden solaparse, es lógico pensar que el diseño de un panel que incluya a todos aquellos genes conocidos que se relacionan con cualquiera de las DHH descritas hasta el momento podría contribuir a un mejor diagnóstico de estas enfermedades. Incluso, a igualdad de tiempo y coste, estas plataformas pueden rastrear mutaciones en muchos más genes que la secuenciación clásica de Sanger. Por lo tanto, la secuenciación masiva parece una herramienta idónea para avanzar en el diagnóstico de estas enfermedades. Así, hemos planteado el análisis simultáneo de un gran número de genes y exones mediante dos tipos de paneles de genes, uno encaminado a los trastornos de la hemostasia primaria y otro, a la secundaria. Como veremos más adelante, hemos empleado la captura de secuencia que es idónea para secuenciar alteraciones genéticas hereditarias que ocurren en el 50-100% de las células, de manera precisa y asequible económicamente. De hecho, existen precedentes que demuestran cómo la tecnología NGS no sólo es capaz de identificar mutaciones ya descritas con alta eficiencia, sino que también ha logrado encontrar nuevas mutaciones responsables de los síntomas observados en el diagnóstico de las DHH, pretendiendo su incorporación al algoritmo diagnóstico de la ISTH. Como conclusión de lo expuesto, proponemos como hipótesis de trabajo que la NGS permitirá la búsqueda sistemática de mutaciones incluidas en un extenso panel de genes relacionados con alguna de las múltiples manifestaciones de las DHH, lo que contribuirá al diagnóstico correcto de estos pacientes. La finalidad de este panel es su aplicación rutinaria en el diagnóstico de todos los pacientes con sospecha de DHH. De este modo, se incrementará notablemente la posibilidad de obtener un diagnóstico correcto de estos enfermos.