El papel del calcio intravesicular en la secreción celular de líneas neuroendocrinas

Resum

La importancia de la señalización celular por el ión calcio (Ca2+) se debe a la variedad de funciones reguladas por este segundo mensajero intracelular, que van desde la proliferación hasta la muerte celular. En cuanto a exocitosis el calcio es la principal señal que desencadena la secreción del contenido de los gránulos. Dentro de la homeostasis del Ca2+ subcelular generalmente se acepta que los principales reservorios dinámicos de Ca2+ son el retículo endoplásmico, la mitocondria y en menor grado el complejo de Golgi. En células neuroendocrinas los gránulos de secreción constituyen unos de los orgánulos más abundantes y en algunos casos el principal reservorio intracelular de Ca2+, conteniendo concentraciones totales de este ión incluso mayores que las del retículo endoplásmico. Se ha propuesto que los mecanismos de captación y liberación de Ca2+ vesicular podrían contribuir a la propia exocitosis. Gracias a la fotoproteína aequorina (AEQ) dirigida a gránulos de secreción, nuestro laboratorio así como otros autores han podido esclarecer parte de estos mecanismos. Sin embargo estos difieren considerablemente en función del tipo celular e incluso generando respuestas heterogéneas para ciertos estímulos. Estas respuestas ponen de manifiesto la existencia de poblaciones vesiculares que no simplemente se diferencian en su estado de maduración y cinética sino también en términos de homeostasis de Ca2+. Se necesitan por tanto nuevas aproximaciones y herramientas para determinar el significado fisiológico de la dinámica del Ca2+ en estos orgánulos. El objetivo de este trabajo es por tanto profundizar en el estudio de la dinámica de Ca2+ vesicular mediante experimentos realizados en población celular y aproximarse a la dinámica de subpoblaciones vesiculares mediante estudios de Ca2+ granular por técnicas de imagen de fluorescencia en célula única. Para realizar las medidas de Ca2+ intracelulares se han utilizado tanto sondas de AEQ como diversos indicadores de Ca2+ codificados genéticamente, en concreto rtPericam y los indicadores de la familia GECO (Genetically Encoded Ca2+ indicators for Optical Imaging) RGECO1, y los ratiométricos GEMGECO1 de doble emisión, y GEXGECO1 de doble excitación. Estas sondas han sido dirigidas a los gránulos con las secuencias de sinaptobrevina (VAMP), cromogranina A (CgA) y neuropéptido Y (NPY) en un estudio comparativo entre las líneas celulares cromafines de rata PC12, especializada en la secreción de catecolaminas, y las líneas celulares derivadas de células β-pancreáticas, INS-1 y su clon INS-1E, especializadas en la secreción de insulina. En esas dos últimas líneas celulares β-pancreáticas también se han abordado aspectos de la dinámica de Ca2+ en el retículo endoplásmico, mitocondria, citosol y en la zona submembrana plasmática, por medio de sondas de AEQ dirigidas a dichas localizaciones celulares. Las imágenes de microscopía confocal de la localización subcelular de las sondas VAMP-EGFP, CgA-EGFP y NPY-EGFP mostraron patrones granulares para las líneas celulares neuroendocrinas PC12, INS-1 e INS-1E. Este hecho corrobora la localización vesicular de las sondas CgA-mAEQ y NPY-mAEQ. Funcionalmente la localización en la matriz granular de las sondas de AEQ supone ventajas experimentales con respecto a la sonda VAMP-mAEQ anclada en la membrana. Los resultados obtenidos con las sonda NPY-mAEQ en poblaciones celulares de líneas neuroendocrinas PC12, INS-1 e INS-1E muestran que la concentración basal de Ca2+ libre en la matriz densa de los gránulos de secreción, se sitúa entre 20-40μM. Los valores obtenidos con la sonda CgA-mAEQ fueron considerablemente más bajos, sugiriendo la posibilidad de que la CgA pueda tamponar la concentración de Ca2+, bien por sus características físico-químicas, o las del entorno donde se distribuye. Los mecanismos responsables de los flujos de Ca2+ vesiculares en las líneas celulares PC12, INS-1 e INS-1E son similares. La acumulación de Ca2+ vesicular se da fundamentalmente a través de las ATPasas de Ca2+ del retículo sarco/endoplásmico (SERCA) con una pequeña contribución de un intercambiador Ca2+/H+. La liberación de Ca2+ vesicular es mayoritariamente dependiente de receptores de inositol(1,4,5)trifosfato (IP3R) y receptores de rianodina (RyR). En estos tipos celulares, la escasa contribución de los segundos mensajeros cADPR y NAADP sugiere que carecen de sus receptores específicos. Tanto los cambios en el nivel de glucosa en el caso de células INS-1 e INS-1E como la estimulación con alto K+ en las líneas celulares neuroendocrinas generan respuestas heterogéneas que sugieren la participación de diferentes subpoblaciones vesiculares en términos de dinámica de Ca2+, regulando la señal de Ca2+ y el proceso de exocitosis. Un análisis comparativo más detallado de la repuesta frente a alto K+ en las líneas celulares INS-1 e INS-1E ha mostrado diferencias fisiológicas importantes entre ambas. Para las células INS-1, con una alta tasa de expresión de canales de Ca2+ voltaje-dependientes (VOCC), la regulación de la respuesta de Ca2+ en la secreción podría venir condicionada por un sistema VOCC-mitocondria-gránulos de secreción. Para células INS-1E, una baja expresión de VOCC se compensaría con una regulación estrecha, prácticamente de acoplamiento, entre VOCC-gránulos de secreción. Las quimeras fluorescentes dirigidas a gránulos de secreción más eficaces para detectar variaciones de la concentración de Ca2+ en el medio ácido intragranular han sido VAMP-GEM(GEX)GECO1, y NPY-GEM(GEX)GECO1. Las sondas con rtPericam y aquellas con la secuencia CgA no se expresaron correctamente en gránulos de secreción. En el caso de VAMP-RGECO1, si bien la adición de glicerol mejoró su distribución granular, la sonda no fue capaz de detectar variaciones en la concentración de Ca2+ granular. El estudio de la dinámica de Ca2+ vesicular en célula única, en líneas celulares PC12 e INS-1, ha proporcionado resultados consistentes con los obtenidos en población celular. Por un lado, la acumulación de Ca2+ vesicular se realizó a través de ATPasas tipo SERCA. Por otro lado, los estímulos de despolarización con alto K+ y ATP produjeron aumentos transitorios en la concentración de Ca2+ vesicular. En los estudios realizados en célula única se han considerado tres regiones arbitrarias de posibles subpoblaciones vesiculares: periférica, intermedia y central. Las variaciones de la concentración de Ca2+ vesicular en respuesta a diferentes maniobras, son de menor magnitud y más lentas conforme nos alejamos de la membrana plasmática. Estas diferencias pueden deberse a la progresión de la onda de Ca2+ a través de la célula, o bien ser causadas por un mecanismo asociado al almacenamiento del calcio total intragranular y/o el proceso de maduración de los gránulos de secreción a lo largo de su recorrido hacia la membrana plasmática. Los datos obtenidos tanto en los registros en población celular como en célula única apoyan la hipótesis de que la liberación del Ca2+ intragranular puede contribuir a su propia secreción. Los estímulos que inducen secreción también liberan Ca2+ de los gránulos de secreción, y en el caso concreto de la línea INS-1E nuestros datos sugieren la existencia de un acoplamiento directo entre los VOCC de la membrana plasmática y los RyR o IP3R de los gránulos de secreción, capaz de desencadenar rápidamente liberación de Ca2+ inducida por Ca2+ (CICR).