Evaluación del efecto del óxido nítrico sobre la expresión génica en células madre embrionarias

Zusammenfassung

El principal objetivo del presente trabajo es analizar el efecto global de las bajas concentraciones de oxido nítrico sobre la biología de las células madre. La expresión de las diversas isoformas de la óxido nítrico sintasa (NOS) presenta una dinámica que está relacionada con los procesos de autorrenovación y diferenciación. La disminución de la expresión de eNOS está relacionada con la pérdida de pluripotencialidad y el incremento de la expresión de iNOS con la ganancia de diferenciación. Así mismo, las bajas concentraciones de óxido nítrico suministrado exógenamente tienen un efecto positivo sobre la autorrenovación de las CMEs de ratón y humanas, siendo la concentración óptima la de 2 ¿M para el donador DETA-NO que correlaciona con una baja tasa de muerte celular y altos niveles de expresión de marcadores de pluripotencia. Las células que sobreexpresan eNOS muestran un mismo patrón de expresión que el tratamiento con bajas concentraciones de DETA-NO. A concentraciones mayores de 50 uM se obtienen resultados opuestos. El tratamiento con 2uM de DETA-NO sobre las CMEs cultivadas en ausencia de LIF ofrece un patrón de expresión génica del circuito básico de regulación de la pluripotencia incrementando la expresión de marcadores clásicos (Oct4, Nanog y Sox2) y disminuyendo la expresión de cMyc y Rex1. A nivel transcriptómico el tratamiento con 2uM de DETA-NO promueve un perfil de expresión para un grupo de genes, similar al de las células no diferenciadas (cultivadas en presencia de LIF o bFGF), mientras que para otro grupo confiere un patrón de expresión exclusivo debido al tratamiento. Entre los genes comunes encontramos algunos genes que intervienen en el proceso de autorrenovación en vías no clásicas. Es importante concluir que el tratamiento con NO por si solo no es suficiente para el mantenimiento del estado de pluripotencia de las células madre embrionarias. Durante el análisis del transcriptoma de las células tratadas con NO, no ha sido posible encontrar evidencias de diferenciación clara hacia ningún tipo celular específico. Por el contrario todos nuestros datos indican que hay una regulación génica dirigida hacia inhibir la entrada al proceso de diferenciación. Bajas concentraciones de óxido nítrico regulan positivamente la expresión de genes anti-apoptóticos y negativamente los pro-apoptóticos. Además hemos encontrado que el óxido nítrico controla el ciclo celular de las CMEs de ratón, provocando un bloqueo en la fase G2/M. Finalmente podemos concluir que el cultivo bajo estas condiciones de NO puede contribuir al mantenimiento del estado no diferenciado de las CMEs reemplazando, no en su totalidad, a factores como el LIF o el bFGF, lo cual puede ser usado en el mejoramiento de los cultivos de células madre