Mecanismo y regulación de la citoquinesis en la levadura Saccharomyces cerevisiae

Resumen

En la levadura Saccharomyces cerevisiae, la contracción del anillo de actomiosina durante la citoquinesis va acompañada de la formación de una capa especial de matriz extracelular producida por la enzima quitín sintasa Chs2. Esta quitín sintasa es esencial y sintetiza el denominado septo primario de quitina entre la célula madre y la célula hija durante la citoquinesis en S. cerevisiae. Ambos procesos están relacionados porque defectos en la contracción del anillo impide la formación del septo primario y, del mismo modo, el bloqueo de la síntesis del septo afecta a la contracción del anillo. Para entender mejor el funcionamiento de esta enzima, en el laboratorio nos planteamos una caracterización estructural de la misma. Para ello, expresamos en S. cerevisiae la proteína Chs2 fusionada a la proteína GFP y a una cola de histidinas, lo cual permitía su visualización y purificación. Tras comprobar que sólo la construcción de la proteína completa y una versión de la proteína que carecía del dominio N-terminal de Chs2 se expresaban a un rendimiento aceptable, encontramos que sólo la proteína completa era solubilizable en el detergente dodecil maltósido. La utilización de otros detergentes no mejoró el proceso de solubilización, pero sí la adición de chaperonas químicas al medio, especialmente la adición de histidina. Sin embargo, los niveles de degradación asociados a la purificación de la proteína Chs2 eran demasiado elevados. Trabajos previos del laboratorio habían mostrado que la proteína Chs2 interaccionaba directamente con la proteína Inn1, por ello nos planteamos que la coexpresión de Chs2 e Inn1 podían mejorar el rendimiento. Efectivamente, los niveles de proteínas que fuimos capaces de aislar fueron mayores, sin embargo, la concentración de proteína Chs2 que obtuvimos no fue suficiente para llevar a cabo estudios estructurales. Paralelamente, el laboratorio del Dr. Alberto Sánchez Díaz de la Universidad de Cantabria estaba interesado en conocer el mecanismo molecular por el que las células de S. cerevisiae regulan la actividad de la quitín sintasa Chs2. Evidencias generadas por nuestro laboratorio y otros apuntaban a que la proteína Inn1 podría tener un papel importante en la regulación de Chs2. Por ello, la Dra. Magdalena Foltman a través de una purificación de proteínas aisló un conjunto de proteínas que son capaces de interaccionar al mismo tiempo con Chs2 e Inn1 durante la citoquinesis. Entre esas proteínas estaba la proteína Cyk3, cuya implicación en la citoquinesis estaba descrita en la literatura. Así, células con la función de Cyk3 comprometida sufrían defectos en la división celular; y la sobreexpresión de Cyk3 provocaba la síntesis de un septo primario más grueso. Sin embargo, se desconocían los detalles moleculares de cuál era el papel que Cyk3 jugaba durante la citoquinesis, por ello decidimos centrar nuestros estudios en la proteína Cyk3. Ya que se había descrito la influencia de Cyk3 en la actividad quitín sintasa, decidimos comprobar si Cyk3 era capaz de interaccionar con Chs2. Para ello, células expresando Cyk3 fusionado con la etiqueta TAP en su extremo N-terminal, y Chs2 con la etiqueta 9MYC, se recolectaron mientras realizaban citoquinesis de manera síncrona. Después de obtener extractos proteicos de estas células, se inmunoprecipitaron dichos extractos en resina cubierta de inmunoglobulina G, comprobando que ambas proteínas interaccionan específicamente en células haciendo citoquinesis. Posteriormente, para comprobar si estas dos proteínas interaccionaban de forma directa, utilizamos un sistema de expresión procariota. Células de E. coli expresando Cyk3-6HIS o Strep-Chs2-215-629 (fragmento que contiene el dominio catalítico de Chs2) fueron mezcladas y los extractos proteicos fueron purificados primero por la etiqueta de Strep y luego por la cola de histidinas. Así, comprobamos que estas dos proteínas interaccionan de forma directa. Para entender mejor la función de Cyk3, decidimos incorporar en el extremo 3’ de la región codificante de CYK3 una etiqueta de degrón de auxina (-aid), que permite la degradación de la proteína de fusión mediante la expresión de una ubiquitina ligasa y la adición de auxinas al medio. Sin embargo, ya que la reducción en la cantidad de Cyk3 no era notable, y el defecto en el fenotipo no era demasiado pronunciado, decidimos, añadir en el extremo 5’ de la región codificante de Cyk3 una etiqueta de degrón de temperatura (-td). Esta etiqueta permite la degradación de la proteína mediante la expresión de una ubiquitina ligasa y un aumento de temperatura en la que crecen las células de 24°C a 37°C. La inactivación del doble degrón de Cyk3 provocó claramente un defecto en citoquinesis. Por tanto, generamos una herramienta importante para analizar la función de Cyk3. La inactivación de Cyk3 provoca un incremento de la localización de Inn1 y Chs2, lo que se podría explicar porque las células sufren un retraso durante la citoquinesis. Sin embargo, la falta de Cyk3 produce un ligero defecto en la síntesis del seto primario entre la célula madre y la célula hija durante la citoquinesis, lo que apuntaría de nuevo a un papel relevante para Cyk3 en la regulación de la formación de ese septo primario. El estudio de proteínas no esenciales como Cyk3 es complicado porque se deben encontrar las condiciones en las que esas proteínas se vuelvan esenciales y así poder estudiar los defectos asociados a su falta. La proteína Cyk3 se convierte en esencial en células que portan la fusión del dominio C2 de Inn1 y la proteína Hof1. Esta fusión es completamente funcional, proporcionando la función completa de Hof1, ya que esta fusión no es letal sintética con otras deleciones de genes con las que, sin embargo, la deleción de Hof1 sí lo es. Por tanto, quisimos caracterizar los defectos asociados a células portadoras de la fusión C2-HOF1, en las que inactivamos Cyk3. Cyk3 tiene un dominio SH3 en su extremo N-terminal y un dominio similar a un dominio transglutaminasa que se encuentra en el centro de su secuencia. La deleción del dominio SH3 provoca graves defectos en la división celular; y la combinación de este alelo con la fusión C2-Hof1 es letal sintética. Igualmente, este dominio es imprescindible para la correcta localización de Cyk3 en el sitio de división. El mapeo de los sitios de interacción de Cyk3 con dos fragmentos de Chs2 reveló que Cyk3 es capaz de interaccionar mediante múltiples puntos de contacto a lo largo de dos fragmentos de Chs2 que contiene el dominio catalítico. Además, uno de los fragmentos de Cyk3 (475-764aa) es incapaz de interaccionar con un fragmento de Chs2 que contiene también su extremo N-terminal (1-629aa), sugiriendo que el extremo N-terminal de Chs2 impide la interacción entre ambas proteínas. De las truncaciones de Cyk3, se eligió el fragmento Cyk3-475-885, que se conocía por la literatura que era soluble, para comprobar en ensayos de interacción en proteína recombinante expresada en E. coli que la interacción con Chs2 se produce de forma directa, del mismo modo que con la proteína completa. Este fragmento contiene el dominio similar a transglutaminasa, con dos residuos clave conservados: una histidina y un ácido aspártico. La mutación de ambos residuos eliminó la función de Cyk3, ya que la combinación de este alelo con C2-HOF1 resultó en una letalidad sintética. Este alelo, al contrario que la versión salvaje, es incapaz de inducir la síntesis de septo primario cuando se sobreexpresa, de forma independiente a la localización de la quitín sintasa Chs2. La letalidad sintética del alelo mutante con C2-HOF1 era rescatada por un alelo hipermórfico de Chs2; entender cómo ocurría ese rescate, podría darnos pistas sobre la regulación de esta proteína. Hemos comprobamos que el dominio C-terminal de Inn1 interacciona con Chs2 y nuestros resultados apuntan a un papel regulador negativo del extremo C-terminal de Inn1 sobre la actividad quitín sintasa de Chs2. Nuestros experimentos indican que Cyk3 tiene un papel en la regulación de la actividad de Chs2 porque las células C2-HOF1 desprovistas de Cyk3 son incapaces de llevar a cabo la formación del septo primario, lo que explica la razón por la que esas células mueren.