Estudio del mecanismo de acción de la toxina adenilato ciclasa de bordetella pertussis

Resum

La aparición de nuevas enfermedades infecciosas junto con el resurgimiento de otras que se creían casi erradicadas, así como la detección de resistencias a fármacos existentes, ha puesto de manifiesto la necesidad e importancia de esclarecer las bases moleculares de las enfermedades causadas por virus y bacterias. En la presente Tesis se ha abordado el estudio del mecanismo de acción de la toxina adenilato ciclasa, uno de los principales factores de virulencia secretado por Bordetella pertussis, la bacteria causante de la tosferina. La ACT es una toxina proteica de gran tamaño (1706 aminoácidos) formada por dos dominios, un dominio N-terminal (aminoacidos 1-382) que posee actividad catalítica adenilato ciclasa (dominio AC) y un domino C-terminal (¿ 400-1706) que posee, cuatro alfa-hélices que se unen a membranas y una región de unión a calcio (dominio RTX) homóloga a otras toxinas hemolíticas pertenecientes a la familia RTX (Repeats in ToXin). La toxina ACT se une con gran afinidad a las células inmunes (macrófagos y neutrófilos) que expresan en su membrana la integrina ¿Mß2, actuando como receptor de la toxina en estas células. Tras la unión al receptor, el dominio RTX se inserta en la membrana de la célula diana y el dominio AC transloca, a través de la membrana, generando grandes cantidades de cAMP bajo la membrana plasmática. Resultados previos obtenidos en este laboratorio han demostrado que el cAMP generado induce la entrada de calcio extracelular a través de canales de calcio tipo L, vía activación de la proteina kinasa A (PKA) celular. En este trabajo se ha encontrado que la toxina adenilato ciclasa es endocitada tanto por células que expresan la integrina ¿Mß2 (macrófagos J774A.1 y células CHO- K1/CR3+) como por células que no expresan este receptor (células CHO-K1 y J774A.1/CR3-). Además se han observado distintas vías de entrada que parecen depender no sólo de la presencia o no del receptor sino también de la propia fisiología y características del tipo celular expuesto a la acción de la toxina. Así, mientras en los macrófagos J774A.1 alrededor de un 80% de la ACT es internalizada vía vesículas de clatrina, en células CHO-K1/CR3+ la proporción de toxina endocitada por esta vía se reduce aproximadamente a un 50% y el otro 50% es captado vía caveolas. En células CHO-K1, prácticamente la totalidad de la toxina parece entrar mediante caveolas, mientras que en células J774A.1/CR3- la toxina es mayoritariamente captada vía vesículas de clatrina, lo cual sugiere que la fisiología específica de la célula y sus características podrían determinar la vía endocítica seguida por la ACT, y que la integrina CD11b/CD18 (integrina ¿Mß2) no se requiere necesariamente para activar la internalización de la ACT vía clatrina en macrófagos. Cabe también destacar que los inhibidores específicos de tirosina quinasas disminuyen significativamente el porcentaje de internalización de la ACT en los cuatro tipos celulares ensayados, lo que sugiere que la ACT podría inducir la activación de tirosina quinasas de la familia Src, que podrían, a su vez, estar involucradas en la activación de las distintas vías endocíticas, a través de la fosforilación de distintos componentes implicados en ellas. Esta hipótesis se refuerza por la fosforilación de la caveolina-1 inducida por ACT en células CHO-K1. Así, la activación de tirosina quinasas solubles de la familia Src podrían ser un denominador común en las diferentes estrategias endocíticas utilizadas por las células diana para internalizar la toxina. Con todo, los resultados obtenidos sugieren que la señalización celular inducida por la ACT en la que participan tirosina quinasas y proteínas quinasas como la PKA dependiente de cAMP, podría mediar la fosforilación de diferentes sustratos celulares involucrados en diferentes vías endocíticas. La vía concreta de señalización activada por la ACT podría pues depender de las características y fisiología celulares así como de los substratos celulares específicos que resulten fosforilados por la quinasas. Otro denominador común encontrado en la endocitosis de la ACT por los distintos tipos celulares es la elevación de la concentración intracelular de calcio inducida por acción de la toxina. Se han descrito respuestas biológicas en las que participa la endocitosis activada por Ca2+ como respuesta de las células a rupturas en la membrana, inducidas tanto por fuerzas mecánicas como por distintas proteínas formadoras de poro. La toxina formadora de poros grandes SLO, la toxina formadora de poros pequeños ¿-toxin, y de poros medianos perforina, desencadenan procesos de endocitosis que se correlacionan con el resellado de la membrana plasmática. En el presente trabajo se muestra que la membrana plasmática dañada por la ACT es reparada aproximadamente en 1 hora, tanto en células CHO-K1 como en CHO-K1/CR3+, volviéndose progresivamente impermeables a la entrada de ioduro de propidio tras la adición de la toxina. La buena correlación entre la escala temporal del proceso de reparación de membrana y la internalización de la ACT apoya la hipótesis de que la eliminación de la toxina de la membrana celular puede formar parte de una respuesta celular de reparación de membrana. Según el modelo actual de actuación de la ACT, los efectos citotóxicos ejercidos por la toxina sobre las células inmunes (inhibición de fagocitosis, inhibición de quimiotaxis, inhibición de la producción de superoxido, etc.) están mediados, fundamentalmente, por la generación suprafisiológica, justo debajo de la membrana plasmática, de cAMP, un importante segundo mensajero para las células eucariotas. Sin embargo, aquí se han descrito efectos tóxicos importantes que tienen lugar lejos de la membrana como, por ejemplo, la inducción de apoptosis en la mitocondria, o la activación de algunos factores de transcripción en el núcleo, los cuales no se explicarían bien únicamente a través de la generación submembranal de cAMP por el dominio AC, particularmente si se considera la baja difusibilidad del cAMP en el citosol. En esta Tesis se planteó la hipótesis de que el dominio catalítico pudiera ser escindido tras la translocación del dominio N-terminal y pudiera actuar a modo de adenilato ciclasa ¿soluble¿. Los resultados obtenidos permiten afirmar que, tras la translocación del dominio AC a través de la membrana, la ACT es escindida proteolíticamente en macrófagos originando dos péptidos catalíticamente activos, de ¿ 40 y 45 kDa, correspondientes al dominio N-terminal de la ACT, que con el tiempo se localizan en el núcleo y la mitocondria. Se propone que la proteasa implicada en el corte podría ser la calpaína celular, una cisteína proteasa dependiente de calcio que resulta activada en la célula como consecuencia de la elevación de calcio intracelular inducida por la propia toxina. Los ensayos de inhibición tanto farmacológica como por silenciamiento génico sugieren que la isoforma denominada calpaína-2 (m-calpaína) es principalmente activada en los macrófagos incubados con ACT a las concentraciones ensayadas, aunque es posible que a concentraciones de toxina inferiores y por tanto, con incrementos menores de la concentración intracelular de calcio inducida por la ACT, solo se active la isoforma denominada calpaína-1 (¿-calpaína). Los resultados obtenidos en los ensayos de corte in vitro realizados con la toxina purificada y calpaína purificada han sido particularmente reveladores. La protección conferida por la pre-incubación de la toxina con calmodulina, que blinda el dominio N- terminal de la toxina de una proteólisis masiva mediada por calpaína, sugiere que la calmodulina puede jugar un papel importante como estabilizador estructural del dominio AC dentro de la célula, además de actuar como activador de la actividad adenilato ciclasa. Recientemente, se ha demostrado que el dominio catalítico purificado comprendido entre los residuos 1-384 de la ACT no es muy estable termodinámicamente y tiende a la agregación de una manera dependiente de la temperatura, mientras que, en presencia de calmodulina, el complejo sufre una compactación y deshidratación significativas. La unión de calmodulina al dominio AC podría pues proveer una estabilidad estructural y/o blindaje del dominio AC para evitar un corte prematuro mediado por la proteasa activa, lo cual aseguraría la liberación de un dominio AC completo y activo al citosol celular. Tras el corte in vitro de la ACT purificada se han identificado dos péptidos catalíticamente activos, similares, si no idénticos, a los obtenidos en las fracciones citosólicas de macrófagos, de masas ¿ 45 y 50 kDa. El hecho de que el dominio catalítico (aminoácidos 1-384) por sí mismo no presente ninguna tendencia de asociación a la membrana y el hecho de que, in vivo, en macrófagos se hayan detectado los fragmentos de 45-50 kDa en orgánulos subcelulares, plantea la suposición del requerimiento de una secuencia de reconocimiento o región de unión a membranas, en la forma ¿soluble¿ del domino AC, que favorezca su migración y anclaje a orgánulos subcelulares. Se ha determinado por espectrometría de masas de fragmentos trípticos de los dos fragmentos de proteína (45 and 50 kDa) derivados del corte in vitro mediado por calpaína que ambos péptidos se extienden más allá del aminoácido 384, hasta el residuo 413 en el caso del fragmento de 45 kDa, y hasta el aminoácido 435 en el caso del fragmento de 50 kDa. Muy recientemente Karst y colaboradores (2012) han descrito que la región 375-485 en la ACT parece tener un papel importante en promover la interacción del dominio catalítico con la membrana plasmática y su translocación a través de la bicapa lipídica de las células diana. Esto permite especular que el corte proteolítico de la ACT mediado por la calpaína podría liberar una forma ¿soluble¿ del domino AC dotado de capacidad catalítica y con la habilidad de asegurar una localización y producción de AMPc subcelular específica. Se ha sugerido que el origen de la ACT pueda encontrarse en la fusión del gen antecesor de la familia RTX con la adenilato ciclasa eucariótica regulada por calmodulina. Recientemente, se ha descubierto la presencia de adenilato ciclasas citosólicas ¿solubles¿ (sAC) en células de mamífero, que son distintas evolutiva, estructural y bioquímicamente de las adenilato ciclasas transmembranales sensibles a proteínas G. Esas sAC se asocian con varios orgánulos intracelulares, incluidos las mitocondrias, los centriolos, el huso mitótico y los núcleos, donde estimulan distintas vías de señalización dependientes de AMPc como la fosforilación de CREB o la apoptosis dependiente de mitocondrias. A la vista de los resultados presentados es tentador especular que el componente enzimático de la ACT podría provenir de una de estas formas solubles de adenilato ciclasas. Esta idea es apoyada por el hecho de que en presencia de HCO3-, un activador conocido de las ACs, la actividad de los fragmentos de 45 y 50 kDa derivados del corte in vitro mediado por la calpaína se ve aumentada significativamente, y en presencia del inhibidor KH7, específico de ACs, la actividad de esos fragmentos es inhibida de manera significativa. escindidaproteolíticamenteenmacrófagosoriginandodospéptidoscatalíticamenteactivos,de¿40y45kDa,correspondientesaldominioN-­¿terminaldelaACT,queconeltiemposelocalizanenelnúcleoylamitocondria.Seproponequelaproteasaimplicadaenelcortepodríaserlacalpaínacelular,unacisteínaproteasadependientedecalcioqueresultaactivadaenlacélulacomoconsecuenciadelaelevacióndecalciointracelularinducidaporlapropiatoxina.Losensayosdeinhibicióntantofarmacológicacomoporsilenciamientogénicosugierenquelaisoformadenominadacalpaína-­¿2(m-­¿calpaína)esprincipalmenteactivadaenlosmacrófagosincubadosconACTalasconcentracionesensayadas,aunqueesposiblequeaconcentracionesdetoxinainferioresyportanto,conincrementosmenoresdelaconcentraciónintracelulardecalcioinducidaporlaACT,soloseactivelaisoformadenominadacalpaína-­¿1(¿-­¿calpaína).Losresultadosobtenidosenlosensayosdecorteinvitrorealizadosconlatoxinapurificadaycalpaínapurificadahansidoparticularmentereveladores.Laprotecciónconferidaporlapre-­¿incubacióndelatoxinaconcalmodulina,queblindaeldominioN-­¿terminaldelatoxinadeunaproteólisismasivamediadaporcalpaína,sugierequelacalmodulinapuedejugarunpapelimportantecomoestabilizadorestructuraldeldominioACdentrodelacélula,ademásdeactuarcomoactivadordelaactividadadenilatociclasa.Recientemente,sehademostradoqueeldominiocatalíticopurificadocomprendidoentrelosresiduos1-­¿384delaACTnoesmuyestabletermodinámicamenteytiendealaagregacióndeunamaneradependientedelatemperatura,mientrasque,enpresenciadecalmodulina,elcomplejosufreunacompactaciónydeshidrataciónsignificativas.LaunióndecalmodulinaaldominioACpodríapuesproveerunaestabilidadestructuraly/oblindajedeldominioACparaevitaruncorteprematuromediadoporlaproteasaactiva,locualaseguraríalaliberacióndeundominioACcompletoyactivoalcitosolcelular.TraselcorteinvitrodelaACTpurificadasehanidentificadodospéptidoscatalíticamenteactivos,similares,sinoidénticos,alosobtenidosenlasfraccionescitosólicasdemacrófagos,demasas¿45y50kDa.Elhechodequeeldominiocatalítico(aminoácidos1-­¿384)porsímismonopresenteningunatendenciadeasociaciónalamembranayelhechodeque,invivo,enmacrófagossehayandetectadolosfragmentosde45-­¿50kDaenorgánulossubcelulares,plantealasuposicióndelrequerimientodeunasecuenciadereconocimientooregióndeuniónamembranas,enlaforma¿soluble¿deldominoAC,quefavorezcasumigraciónyanclajeaorgánulossubcelulares.Sehadeterminadoporespectrometríademasasdefragmentostrípticosdelosdosfragmentosdeproteína(45and50kDa)derivadosdelcorteinvitromediadoporcalpaínaqueambospéptidosseextiendenmásalládelaminoácido384,hastaelresiduo413enelcasodelfragmentode45kDa,yhastaelaminoácido435enelcasodelfragmentode50kDa.MuyrecientementeKarstycolaboradores(2012)handescritoquelaregión375-­¿485enlaACTparecetenerunpapelimportanteenpromoverlainteraccióndeldominiocatalíticoconlamembranaplasmáticaysutranslocaciónatravésdelabicapalipídicadelascélulasdiana.EstopermiteespecularqueelcorteproteolíticodelaACTmediadoporlacalpaínapodríaliberarunaforma¿soluble¿deldominoACdotadodecapacidadcatalíticayconlahabilidaddeasegurarunalocalizaciónyproduccióndeAMPcsubcelularespecífica.SehasugeridoqueelorigendelaACTpuedaencontrarseenlafusióndelgenantecesordelafamiliaRTXconlaadenilatociclasaeucarióticareguladaporcalmodulina.Recientemente,sehadescubiertolapresenciadeadenilatociclasascitosólicas¿solubles¿(sAC)encélulasdemamífero,quesondistintasevolutiva,estructuralybioquímicamentedelasadenilatociclasastransmembranalessensiblesaproteínasG.EsassACseasocianconvariosorgánulosintracelulares,incluidoslasmitocondrias,loscentriolos,elhusomitóticoylosnúcleos,dondeestimulandistintasvíasdeseñalizacióndependientesdeAMPccomolafosforilacióndeCREBolaapoptosisdependientedemitocondrias.AlavistadelosresultadospresentadosestentadorespecularqueelcomponenteenzimáticodelaACTpodríaprovenirdeunadeestasformassolublesdeadenilatociclasas.EstaideaesapoyadaporelhechodequeenpresenciadeHCO3-­¿,unactivadorconocidodelasACs,laactividaddelosfragmentosde45y50kDaderivadosdelcorteinvitromediadoporlacalpaínaseveaumentadasignificativamente,yenpresenciadelinhibidorKH7,específicodeACs,laactividaddeesosfragmentosesinhibidademanerasignificativa