Degradación de material lignocelulósico. Evaluación de pretratamientos químicos e hidrólisis enzimáticas para la obtención de alcoholes por fermentación

Laburpena

Durante los últimos años, ha habido un interés creciente en la producción de etanol y butanol como biocombustibles alternativos debido a dos razones fundamentales: la tasa finita de combustibles fósiles y el deterioro ambiental del planeta. Los residuos lignocelulósicos permiten la producción de biocombustibles de segunda generación (2G), ya que no se emplean en alimentación humana ni animal. El butanol como biocarburante tiene mayores ventajas que el etanol debido a su mayor poder calorífico y su seguridad en el manejo. Sin embargo, en la producción de biobutanol 2G todavía hay muchos desafíos que deben resolverse para que el proceso sea rentable y pueda competir con la ruta petroquímica convencional. Así, el pretratamiento de los materiales lignocelulósicos para alterar su estructura recalcitrante, etapa crucial en la producción de biobutanol, presenta aún muchas posibilidades de mejora, así como la selección de microrganismos fermentadores eficaces y la identificación detallada de los compuestos presentes en los hidrolizados que pueden actuar como inhibidores de la fermentación. La presente Tesis Doctoral se ha centrado en el estudio del proceso de hidrólisis de distintos tipos de biomasas lignocelulósicas: un cultivo energético (Panicum virgatum) y cuatro residuos de la industria agroalimentaria (bagazo de manzana, piel de patata, bagazo de cerveza y piel de grano de café). Así, se ha comparado la eficacia de diferentes pretratamientos físico-químicos (basados en el uso de ácidos, álcalis, solventes orgánicos y compuestos surfactantes), seguidos de una etapa de hidrólisis enzimática, para recuperar azúcares fermentables que se puedan utilizar en la fermentación acetona-butanol-etanol (ABE) con Clostridium spp. En la primera parte de este trabajo, se utilizó la metodología de superficie de respuesta (RSM) para investigar el efecto de las principales condiciones de operación del pretratamiento con ácido sulfúrico diluido de P. virgatum. Se aplicó un diseño rotatorio central compuesto (CCRD) para evaluar el efecto de la concentración de ácido (0,16 – 1,84%, p/p), la carga de biomasa (4,9 – 30,0%, p/p) y el tiempo de hidrólisis (9,6 – 110,5 min) a 121 °C, en el rendimiento de la recuperación de azúcares fermentables y de inhibidores totales generados [ácido acético, ácido levulínico, 5-hidroximetilfurfural (5-HMF) y furfural] con el fin de alcanzar un compromiso entre ambas respuestas. Los resultados mostraron que la recuperación total de azúcares fermentables y la generación de inhibidores de la fermentación dependen fuertemente de la concentración de ácido mientras que la dependencia es menos significativa para la carga de sólido y el tiempo de hidrólisis. Las condiciones de hidrólisis óptimas calculadas por el modelo fueron 1,72% (p/p) de concentración de ácido sulfúrico y 112,0 min de tiempo de hidrólisis a 121 °C, para un valor fijo de 10,0% (p/p) de carga de biomasa. Bajo estas condiciones de pretratamiento, y una posterior etapa de hidrólisis enzimática, se obtuvo una cantidad de azúcares hidrolizados de 502,2 mg g-1 (78,8% de rendimiento de recuperación de azúcares) y una cantidad total de compuestos inhibidores generados de 42,9 mg g-1. A continuación, se procedió a estudiar la producción de biobutanol a partir del hidrolizado ácido hemicelulósico de P. virgatum, obtenido en las condiciones óptimas descritas en el párrafo anterior. La cepa Clostridium beijerinckii CECT 508 se seleccionó entre ocho cepas silvestres como la más eficiente para producir butanol a partir de mezclas de glucosa / xilosa. Además, se analizó el efecto de inhibición en la fermentación ABE producido por los compuestos presentes en el hidrolizado ácido. Para ello, se utilizaron medios de fermentación modelo y se observó que los inhibidores que más interfieren en la fermentación, cuando se encuentran en las concentraciones detectadas en el hidrolizado ácido (indicadas entre paréntesis), fueron: ácido acético (3,30 g L-1) > compuestos fenólicos (1,00 g L-1) > sulfatos (16,87 g L-1) > furfural (0,60 g L-1), mientras que el 5-HMF (0,20 g L-1) y el ácido levulínico (0,30 g L-1) no mostraron tener ningún efecto sobre la fermentación. Se evaluaron varios tratamientos físico-químicos de detoxificación, incluida la evaporación, la detoxificación con cal y la adsorción con carbón activado, para eliminar los inhibidores del hidrolizado ácido de P.virgatum. Aunque el carbón activado fue el método más efectivo en cuanto a la reducción de compuestos fenólicos, furfural, 5-HMF y ácido levulínico, no se observaron diferencias significativas en la producción de butanol entre los hidrolizados no detoxificados y los detoxificados. C. beijerinckii CECT 508 fermentó con éxito el hidrolizado ácido de P. virgatum no detoxificado (que contenía 26 g L-1 de xilosa, 4 g L-1 de glucosa y 4 g L-1 de arabinosa) y se obtuvo una producción de butanol de 4.00 ± 0.71 g L-1 (rendimiento 0,184 ± 0,032 g g-1) y una producción de solventes ABE de 4,70 ± 0,91 g L-1 (rendimiento 0,216 ± 0,041 g g-1). Por último, se analizó la presencia de compuestos inhibidores en los hidrolizados de cuatro residuos de la industria agroalimentaria (bagazo de manzana, piel de patata, bagazo de cerveza y piel de grano de café) obtenidos después de la aplicación de diferentes pretratamientos químicos basados en el uso de ácidos, álcalis, solventes orgánicos y compuestos surfactantes, bajo idénticas condiciones de operación (121 °C, 2 h). Se identificaron sesenta y siete compuestos mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas en tándem (GC-MS/MS), y se clasificaron en compuestos no aromáticos (ácidos alifáticos, compuestos que contienen nitrógeno, furanos y ácidos grasos) y compuestos aromáticos (fenólicos y no fenólicos). Después, se desarrolló y validó un método de cromatografía líquida de alta resolución con detección de matriz de diodos (HPLC-DAD) para la cuantificación de los inhibidores potenciales de la fermentación ABE más frecuentemente identificados en los hidrolizados de los residuos agroalimentarios (es decir, los ácidos gálico, 3,4-dihidroxibenzoico, 2,5-dihidroxibenzoico, 4-hidroxibenzoico, 3-hidroxibenzoico, vainíllico, cafeico, siríngico, p-cumárico y ferúlico, vainillina, siringaldehído y cafeína). El método desarrollado mediante HPLC-DAD es simple, rápido y robusto, permite la inyección directa de las muestras sin tratamiento previo y hace posible la cuantificación simultánea de los compuestos mencionados anteriormente. Como conclusión general de la Tesis Doctoral es preciso destacar que, para cada biomasa lignocelulósica, la selección del tipo y las condiciones del pretratamiento es una etapa crucial en el aumento de la rentabilidad de la producción de butanol mediante fermentación ABE, ya que condiciona tanto la concentración de azúcares fermentables obtenida en el hidrolizado, como la cantidad y tipo de los compuestos inhibidores presentes. Además, es también fundamental la selección de una cepa productora de butanol adecuada para cada hidrolizado.