Soportes híbridos polímero/fibrina para ingeniería tisular

Resumen

Soportes híbridos polímero/fibrina se sintetizaron con el fin de ser usados en diversas aplicaciones de ingeniería tisular. Polímeros sintéticos basados en poliésteres y un polímero natural, el quitosano, se combinaron con fibrina mediante diferentes metodologías de preparación de scaffolds. Inicialmente se desarrolló recubrimientos de fibrina sobre scaffolds de ácido poli(L-láctico) (PLLA), y policaprolactona (PCL), y posteriormente, se desarrolló geles inyectables para ingeniería tisular utilizando la fibrina como agente aglomerante de micropartículas de quitosano de grado médico. La fibrina es una proteína muy utilizada en el área clínica como adhesivo y agente hemostático. Este biopolímero es producto de la activación del fibrinógeno por la trombina. Debido a la posibilidad de obtenerla autólogamente, en medicina regenerativa se ha pensado en combinarla con otros polímeros con el fin de proporcionar secuencias reconocibles por las células y al mismo tiempo evitar rechazo inmunológico cuando se produce la implantación de scaffolds biodegradables. Para tener una idea del comportamiento de la fibrina en medio fisiológico, se realizó una caracterización de las propiedades básicas de la proteína midiendo la cinética de coagulación y degradación del gel utilizando un espectrofotómetro multiplaca, también se estudió a través de microscopio electrónico de barrido (SEM) la morfología de las redes tridimensionales formadas, teniendo como resultado una estructura fibrilar que se puede modular variando la cantidad de trombina y/o fibrinógeno utilizado, y a la que se le puede controlar el proceso de fibrinólisis mediante el uso de un agente entrecruzador de la proteína, el genipin. También se realizó una caracterización biológica sembrando in vitro condrocitos humanos sobre films y geles de fibrina entrecruzados con una solución acuosa de genipin 5mM en diferentes condiciones de cultivo; films de fibrina entrecruzados sin ningún tipo de estimulación externa, y geles reticulados en ausencia y presencia de estímulos mecánicos. La estimulación mecánica utilizada después de 28 días de cultivo produjo una mayor síntesis de proteínas de la matriz extracelular respecto a los films y geles no estimulados. La estructura y distribución de todos los soportes híbridos obtenidos fue estudiada a través de SEM. Los sustratos macroporosos de poliésteres mostraron un recubrimiento con apariencia fibrilar para los scaffolds de PLLA y una fina telilla cubriendo los microporos del scaffold para la PCL; mientras que para las micropartículas de quitosano se encontró que la fibrina agrupa todas las partículas en un solo sistema. En los scaffolds híbridos sintetizados se realizaron cultivos in vitro para caracterizar la respuesta de las células a estas estructuras modificadas; mediante SEM y microscopía confocal se observó la morfología celular y la expresión de proteínas que forman las adhesiones focales en los constructos formados a partir de poliésteres. La naturaleza sintética e hidrófoba de los poliésteres no favorece la adhesión directa de diversos tipos celulares (es necesaria la deposición de proteínas de adhesión celular), por lo tanto, después de la deposición del recubrimiento de fibrina sobre los scaffolds de PLLA, se encontró una mejor distribución y adhesión de células preosteoblásticas de ratón MC3T3-E1 cuando se realizaron cultivos in vitro a cortos tiempos; sin embargo, en el scaffold de PCL recubierto con fibrina (PCL-Fbn), no se observó una mejor distribución de condrocitos cultivados sobre el sustrato híbrido a cortos tiempos. Se realizó un cultivo de condrocitos a largos periodos de tiempos sobre PCL-Fbn con un estímulo de agitación mecánica para promover el mantenimiento del fenotipo de la célula, sin embargo, al finalizar el tiempo de cultivo se encontró un aumento significativo en la proliferación celular y un contenido de glicosaminoglicanos inferior al registrado al inicio del ensayo. Se realizó cultivos in vitro de condrocitos humanos en condiciones estáticas sobre el gel híbrido inyectable de quitosano, y se comprobó que la combinación de estos polímeros naturales entrecruzados con una concentración de genipin 5mM proporciona a la célula un entorno natural similar al fisiológico. Después de 28 días de cultivo se observó un incremento en la producción de proteínas de la matriz extracelular como el colágeno tipo II y la síntesis de glicosaminoglicanos, además también se encontró una reducida proliferación celular en la superficie del soporte. Es importante mencionar que todas estas características indican que ha sido posible mantener células condrocíticas diferenciadas en este entorno tridimensional. Posiblemente los resultados obtenidos con este scaffold híbrido se mejoren utilizando estimulación mecánica y reduciendo el grado de entrecruzamiento de las muestras. Como trabajo futuro se puede implementar una manera de reticular los geles in situ de forma que este sistema se convierta en un scaffold inyectable con propiedades que estimulen la formación de tejido cartilaginoso articular.