Evaluación de las propiedades ópticas de un modelo de estroma corneal humano artificial de fibrina y agarosa generado por ingeniería tisular

Resumen

INTRODUCCIÓN: La córnea es una estructura fibrosa y avascular situada en la abertura anterior de la esclerótica de la cual difiere por su gran transparencia. De las diferentes capas que conforman la córnea humana, el estroma es la más importante en espesor, suponiendo un 90% del total corneal. Está conformada por una matriz extracelular de fibras de colágeno y de queratocitos. Su gran resistencia y transparencia se deben a la enorme regularidad de las fibras de colágeno y a ser avascular. La propagación de la luz a través de un medio biológico depende principalmente de dos fenómenos físicos, el scattering o dispersión y la absorción, los cuales afectan de forma importante a su transmitancia. Se han desarrollado diferentes modelos que explican la transmitancia corneal (Freund et al., 1986; Meek et al, 2003), los cuales estiman que la transmitancia de la córnea es aproximadamente del 90% en la radiación visible. Cualquier patología puede modificar la estructura interna de la córnea y por tanto comprometer su transparencia. La solución más indicada es el transplante del órgano afectado, pero problemas como la transmisión de enfermedades entre donante y receptor o el posible rechazo del órgano transplantado hace necesario el desarrollo de un sustituto antólogo artificial de córnea humana mediante Ingeniería Tisular. Recientemente, se ha desarrollado un sustituto de espesor completo de córnea de conejo (Alaminos et al, 2006) y parcial humano (González-Andrades, 2009) basado en sustitutos estromales de Fibrina y Agarosa al 0,1%. Para que estos constructos sean idóneos en aplicaciones clínicas, sus propiedades ópticas deben coincidir con las de la córnea nativa. Sin embargo, hasta la fecha no han sido determinadas estas propiedades ópticas, ni cómo influye la concentración de agarosa ni el tiempo de desarrollo en cultivo sobre las mismas. OBJETIVO: Evaluar las propiedades ópticas de un modelo de estroma corneal humano artificial con concentraciones crecientes de Agarosa (0%, 0,025%, 0,05%, 0,1%, 0,2% y 0,3%) y en diferentes semanas de desarrollo en cultivo. MATERIAL Y MÉTODO: A partir de limbos esclerocorneales procedentes de queratoplastias se obtuvieron los cultivos primarios de queratocitos humanos. Con Fibrina humana, las diferentes concentraciones de Agarosa y factores de crecimiento se desarrollaron los diferentes modelos de estroma corneal humano artificial objeto de estudio. Se utilizó la Teoría de Kubelka-Munk, y las relaciones encontradas con Thennadil para la medida y el cálculo de los coeficientes de scattering reducido y absorción, albedo de transporte y transmitancia espectrales para cada uno de los modelos desarrollados. También se calculó la transmitancia en el rango del ultravioleta mediante la ley de Lambert-Beer y el índice de refracción mediante la medida del ángulo de Brewster para las longitudes de onda de 532, 594 y 670nm, los cuales se utilizaron posteriormente para la estimación de la calidad de la imagen retiniana que se obtendrían con dichos sustitutos. Finalmente se procedió al estudio de la proliferación y desarrollo celular a partir de cortes transversales de las muestras teñidas en hematoxilina y eosina. RESULTADOS Y DISCUSIÓN: Los resultados muestran que los constructos de Fibrina y bajas concentraciones de agarosa tienen una proliferación y desarrollo celular significativamente mayor (p<0,001), estando estos resultados de acuerdo con estudios previos (Auftherheide y Athanasiu, 2005) que muestran que la presencia de agarosa ralentiza el desarrollo celular. En cuanto a la transmitancia de la luz visible (400-700nm) de nuestros modelos, encontramos que el comportamiento espectral para todas las semanas de desarrollo y constructos es similar. Este comportamiento espectral coincide con el estimado para una córnea humana nativa. Aunque nuestros valores sean inferiores a ésta, nuestros resultados suponen entre un 70-90% de la transmitancia de una córnea humana. Si realizamos un estudio de la influencia de la transmitancia en relación a la concentración de agarosa y el tiempo de cultivo, encontramos que ésta aumenta con la concentración de agarosa, y es entre las semanas 3ª y 5ª de desarrollo en cultivo cuando se obtienen los valores mayores. Esta transmitancia depende, del scattering y la absorción del medio. Realizando un estudio más exhaustivo sobre estos parámetros encontramos para el albedo de transporte que en estos modelos el scattering es predominante, como ocurre en la gran mayoría de tejidos in vivo (Cheong et al, 1990), y además la absorción cobra una mayor importancia en las longitudes de onda cortas, precisamente como ocurre en la córnea humana nativa (Van der Berg y Tan, 1994). Encontramos un scattering significativamente mayor (p<0,001) para los constructos de menor concentración de agarosa, precisamente los que mayor proliferación, lo que esta de acuerdo con los resultados encontrados por Mourant et al (2000) los cuales relacionan el desarrollo celular con la luz dispersada. El coeficiente de absorción, en cambio, es un parámetro que está relacionado con el tiempo de desarrollo, encontrándose menores valores para éste entre las semanas 1-4 de cultivo. En cuanto al comportamiento de nuestros modelos con relación a la radiación UV, encontramos que su transmitancia para todos los casos es menor del 12%, asemejándose con los valores encontrados para una córnea humana nativa (Kolozsvary et al, 2002), y absorbiendo gran cantidad de radiación UV-B, la más dañina para el ojo humano. Finalmente, el índice de refracción estimado para una longitud de onda de 550nm, encontramos que para las semanas 3ª y 4ª de desarrollo se asemejan a los encontrados para un estroma corneal ex vivo (Patel et al., 2004). CONCLUSIONES: En base a las características histológicas y ópticas anteriormente descritas y analizadas podemos concluir que los modelos de estroma corneal humano artificial de Fibrina-Agarosa con una concentración de 0,1% ó 0,2% y tras 3 a 5 semanas de desarrollo en cultivo podrían ser empleados como base para la generación de una córnea humana artificial de espesor completo. Además, estos modelos serían los más indicados para la construcción de un implante parcial en los tratamientos de queratoplastias lamelar y podrían representar equivalentes corneales de origen animal o humano para la experimentación con diferentes fármacos sin la necesidad de utilizar animales vivos o córneas humanas aptas para trasplante.