Dinámica del calcio reticular en astrocitos corticales

Resumo

Introducción La excitabilidad en la astroglía está controlada por flujos de Ca2+, ya sea por la entrada de Ca2+ a través de la membrana plasmática o por la liberación de Ca2+ a partir de los orgánulos intracelulares, principalmente el retículo endoplásmico (RE). El RE de los astrocitos posee receptores de inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3R) que pueden activarse tras la estimulación de una gran variedad de receptores acoplados a proteínas G que desencadenan la vía metabotrópica, y receptores de rianodina (RyR), que pueden activarse en respuesta a incrementos en el Ca2+ citosólico. Materiales y Métodos Recientemente hemos desarrollado una familia de sensores de Ca2+ llamados GAP (GFP-Aequorin-Protein) basados en una fusión de la fotoproteína aequorina y la proteína fluorescente verde GFP. Estos sensores pueden utilizarse en el modo fluorescente para medir cambios en la [Ca2+]RE por técnicas de imagen, o en el modo bioluminiscente cuando se reconstituyen con su cofactor coelenterazina. Resultados Se generaron variantes de baja afinidad (GAP1-3) para medir las altas concentraciones de Ca2+ que se encuentran en el RE. Los sensores GAP se han dirigido al RE de astrocitos corticales utilizando herramientas virales y se ha demostrando su correcta localización mediante la colocalización con marcadores del RE. Además, se han utilizado astrocitos cultivados aislados de ratones transgénicos que expresaban el sensor. Utilizando las herramientas mencionadas se han realizado medidas simultáneas de la [Ca2+]RE y de la [Ca2+]C con erGAPs y rhod-2, respectivamente. La [Ca2+]RE en astrocitos corticales en reposo se estimó en torno a 400 μM y la estimulación con una dosis máxima de ATP provocó un vaciamiento prácticamente completo y reversible del Ca2+ del RE. Se han registrado por primera vez oscilaciones de Ca2+ coordinadas en el RE y en el citosol, desencadenadas tanto espontáneamente, como por estimulación con diferentes agonistas. La entrada de Ca2+ provocada por una despolarización con alto K+ indujo una liberación rápida del Ca2+ del RE y un aumento en el Ca2+ citosólico, que fueron dependientes de la dosis del estímulo y que se suprimen completamente tras la eliminación del Ca2+ extracelular o por adición de Ni2+. Nuestros resultados demuestran la presencia de Calcium Induced Calcium Release (CICR) en astrocitos corticales. Estos resultados fueron validados tanto en cultivos mixtos de neuronas-glía como en cultivos organotípicos de secciones de corteza cerebral.