Development of advanced modular molecules for innovative devices in delivery of therapeutic agents

Resumen

La falta de especificidad de los agentes terapéuticos de los tejidos afectados sobre los tejidos sanos, efectos secundarios, sigue siendo uno de los principales retos en el desarrollo de nuevas terapias para el tratamientos de diferentes patologías. Por ello, es necesario implementar nuevas terapias mediante las cuales consigamos una acción efectiva en las células diana. A lo largo del tiempo la ciencia de materiales ha perseguido mimetizar las propiedades y características propias que se encuentran en las proteínas naturales. La elastina, dotada de biocompatibilidad, elasticidad y comportamiento termo-sensible está siendo una de las proteínas con resultados relevantes para el desarrollo de nuevas aplicaciones en biomedicina. Partiendo del pentapéptido presente en la elastina natural (VPGXG), se ha creado una gran variedad de recombinámeros tipo elastina (Elastin-Like Recombinamers o ELRs). La variación del aminoácido hospedador X nos permite crear una gran variedad de dispositivos inteligentes con capacidad de responder a distintos estímulos n función del tipo de dispositivo necesario. El objetivo de esta tesis es demostrar la versatilidad de estos recombinámeros para la creación de ELRs capaces de formar nanocomplejos y aplicarlos a fines biomédicos como son la liberación de genes suicidas o incluso fármacos. El trabajo desarrollado en esta tesis aborda todo el proceso de diseño, producción, purificación, caracterización y aplicación directa de los nuevos ELRs. Para ello, se han utilizado una amplia variedad técnicas de ingeniería genética, microbiología, física, química y manejo de animales de experimentación. En el primer capítulo de la tesis aborda el desarrollo de nuevos nanodispositivos híbridos como sistemas avanzados de liberación de fármacos combinando diferentes estrategias terapéuticas frente a prevención de la hiperplasia de la íntima en presencia de defecto vascular. En primer lugar se hizo frente a la necesidad de producir dispositivos implantables con capacidad de liberar un fármaco bloqueante selectivo de los canales Kv1.3 de forma sostenida y controlada en el tiempo. Se aprovechó la versatilidad que nos proporcionan los ELRs para desarrollar dispositivos con distinto mecanismo de aplicación, dispositivos recubiertos implantables o formados in situ en la zona problema. Se utilizaron las lisinas presentes en los biopolímeros ELRs para formar hidrogeles mediante reacciones “click” sin catalizador (Catalyst- Free click chemistry), de las cuales resultará un gel estabilizado mediante enlaces covalentes. La evaluación de la cinética del liberación mostró un perfil sostenido en el tiempo, liberando concentraciones de PAP-1 comprendidas dentro de la dosis terapéutica. Dentro de este capítulo se abrió una nueva línea derivada de los resultados obtenidos con PAP-1, en la cual se desarrolló un nuevo ELRs con diferentes secuencias bioactivas para liberar de manera selectiva un péptido terapéutico (ShK) y bloquear selectivamente el canal Kv1.3. Mediante técnicas de ingeniería genética, se ha construido un biopolímero con elevada complejidad estructural que incluye distintos bloques bioactivos, el bloqueante ShK y una secuencia sensible al corte por metaloproteinasas de la matriz (matrix metalloproteinases o MMPs, en inglés) que haga que se libere cuando entre el contacto con el tejido dañado. La evaluación de la degradación del bloque MMPs demostró la liberación del bloque ShK en presencia de MMPs específicas expresadas en tejidos con defecto vascular. En este trabajo también se evaluó la efectividad in vivo de la terapia génica suicida consistente en la formación de poliplexos compuestos por el biopolímero VOK-PEG-5TR1 en pDNA con el gen de la ricina, diseñados previamente en nuestro laboratorio. Los ensayos in vivo con diferentes dosis de los nanocomplejos mostraron una inhibición significativa y selectiva en el crecimiento del tumor de mama, mostrando una reducción del tamaño del tumor, pero también una disminución de la presencia de células tumorales MUC1 positivas y exhibiendo una reducción clara de la proliferación celular (ki67), neovascularización (CD31) y presencia de colágeno (Picro Sirius), características propias de la patología neoplásica. Por último, el capítulo 3 aborda el diseño y desarrollo de nuevos polímeros ELR basados en una estructura policatiónica con diferentes secuencias bioactivas, anticuerpo de cadena sencilla (single chain variable fragmet o scFv, en inglés) para reconocer de manera selectiva moléculas diana presentes únicamente en el tejido tumoral, mediante las cuales desarrollar terapias génicas suicidas. Uno de los problemas más importantes de la medicina actual es la falta de selectividad de los tratamientos para afectar únicamente a las células diana. La quimioterapia es un ejemplo de ello, ya que afecta tanto a los tumores como a tejidos sanos. Mediante técnicas de ingeniería genética, se han construido dos biopolímeros complejos incluyendo distintos bloques para conseguir el reconocimiento de Tenascin-C, un marcador exclusivo de células tumorales. De esta manera, la complejidad molecular de los biopolímeros ELR determina el reconocimiento de la célula diana, y la presencia de las cargas positivas del bloque ELR incrementa la internalización del agente terapéutico por interacción con las cargas negativas de la membrana plasmática. Se formó el complejo biopolímero-plásmido terapéutico con el gen de la ricina como gen tóxico y se comparó la capacidad de formar nanocomplejos de tamaño y carga superficial adecuados para la liberación de péptidos terapéuticos en el interior celular a distindas dosis de pDNA y ratio scFv/VOK. Finalmente, se comparó la capacidad de reconocimiento de los distintos scFv mediante microbalanza de cristal de cuarzo con monitorización de disipación (Quartz Crystal Microbalance with Dissipation monitoring o QCM-D).