Papel de las apolipoproteínas del fluido cerebroespinal embrionario como factores reguladores de la supervivencia celular

Resumen

El Fluido Cerebroespinal Embrionario (CSF-E) ha sido relacionado con el papel que desempeña en la regulación del comportamiento de las células precursoras neuroepiteliales y durante el desarrollo temprano del cerebro, suministrando señales biológicas de activación de la replicación de los precursores neuroepiteliales a través de factores moléculares como el FGF-2, EFG, IGF, entre otros y factores mecánicos como la presión generada en la cavidad cerebral embrionaria, de la activación de la neurogénesis a través de moléculas como el ácido retinoíco (RBP+Retinol) e induce específicamente la supervivencia de las células neuroepiteliales, las moléculas del CSF-E responsables de este proceso no han sido aún identificadas. El análisis proteómico del CSF-E de pollo y de rata reveló que es un líquido complejo constituido por proteínas de la matriz extraceular, proteínas relacionadas con la regulación de la presión osmótica, el transporte de metales, proteínas implicadas en el transpore de retinol, proteínas antioxidantes y antimicrobianas y algunas desconocidas, entre estos componentes proteícos aparecen unas moléculas denominadas Apolipoproteínas: En el caso del CSF-E de pollo se detectaron dos apolipoproteínas, Apo AI y Apo A IV y en el caso del CSF-E de rata se detectaron cinco apolipoproteínas, Apo AI, Apo AIV, Apo B 48/100, Apo E y Apo M. Las apolipoproteínas son glucoproteínas, que pertenecen a la familia de las lipocalinas y que han sido asociadas con un papel neuroprotector a través de su efecto inhibidor de la muerte celular, mediado por su capacidad de influir en el equilibrio redox y han sido asociadas con un papel en el desarrollo del cerebro embrionario. Los datos obtenidos de la bibliografía, justifican la realización de un estudio para tratar de aclarar el papel biológico de algunos tipos de apolipoproteínas en el desarrollo cerebral temprano y los mecanismos a través de los cuales ejercen dicho papel. Uno de nuestros objetivos ha sido comprobar si las apolipoproteínas detectadas en el CSF-E de pollo y de rata estaban también presentes en el CSF-E de ratón de 11,5 días, los resultados obtenidos mediante inmunoblotting revelan la presencia de Apo AI, Apo AVI, Apo B 48/100, Apo E y Apo M, siendo las apolipoproteínas de mayor concentración Apo B 48/100 y Apo AI. Estos resultados apoyan la teoría de que la presencia de estas moléculas en el CSF durante el desarrollo cerebral podría ser un factor flogeneticamente constante y que la composición del CSF-E probablemente está relacionada con el distinto grado de desarrollo funcionl que alcanza el cerebro en las distintas especies. Otro de los objetivos ha sido comprobar si las apolipoproteínas detectadas en el CSF-E de ratón estaban presentes en el neuroepitelio de ratón y analizar su patrón de expresión en diferentes estadios embrionarios (9,5 a 13.5 días) y en las diferentes vesículas cerebrales (mesencéfalo, diencéfalo, vesículas telencefálicas y rombencéfalo). El análisis del patrón de expresión de las diferentes apolipoproteínas, indica que existen diferencias significativas tanto en el patrón temporal como en el espacial, esto sugiere la existencia de mecanismos en el cerebro en desarrollo capaces de regular ontogénicamente y de forma diferencial la expresión de las distintas apolipoproteínas. El marcaje citoplásmico apical y la existencia de formaciones esféricas marcadas en la superficie apical del neuroepitelio que protruyen hacia la cavidad nos hace pensar en la existencia de un proceso de síntesis y secreción apical por parte de las células neuroepiteliales. El patrón de expresión más complejo fue el de Apo B 48/100 y Apo AI. Otro de nuestros objetivos ha sido comprobar el efecto biológico de las apolipoproteínas mediante su bloqueo en cultivos organotípicos de neuroepitelio. Al ser Apo B 48/100 la apolipoproteína mayoritaria en el CSF-E, con un patrón de expresión complejo en el neuroepitelio y su relación con el correcto desarrollo del esbozo cerebral, hemos centrado nuestro estudio en esta apolipoproteína. Los cultivos organotípicos se realizaron en tres condiciones, en una de ellas unicamente se añadió medio al cultivo, en otra medio + CSF-E de ratón de 11, 5 días y en la otra medio+ CSF-E de ratón de 11,5 días+ Anti Apo B 48/100. En las tres condiciones valoramos la apoptosis, mediante la técnica de TUNEL, la proliferación, mediante la técnica de BrdU y la diferenciación, mediante la inmunodetección de un marcador de diferenciación, la B-III Tubulina. Los resultados revelan que el inmunobloqueo selectivo de la actividad de la apolipoproteína B 48/100, aumenta de forma significativa el proceso de muerte celular programada, al mismo tiempo que produce una disminución significativa de la replicación y no altera el proceso de neurogénesis. Para confirmar estos datos, realizamos un estudio del neuroepitelio de embriones de ratón heterocigotos para la mutación del gen Apo B-100, los resultados obtenidos mostraron un aumento significativo de células apoptóticas en el neuroepitelio cerebral de los embriones heterocigotos en comparación con los embriones wildtype, sin embrago no se altera elproceso de replicación celular y disminuya discreta pero significativamente la neurogénesis. Los resultados nos llevan a pensar que el efecto principal producido por el inmunnobloqueo de la actividad de Apo B en el desarrollo cerebral es un incremento de células apoptoticas, mientras que las diferencias en la influencia sobre la replicación y la neurogénesis, pueden ser una consecuencia del incremento de células apoptóticas o bien estar condicionadas por la duración de la deprivación de Apo B en cada una de las técnicas. Nuestros resultados demuestran que al menos una de las apolipoproteínas mayoritarias en el CSF-E de ratón, Apo B, está relacionada con el proceso de supervivencia de las células neuroepiteliale y nos deja abierta la posibilidad que que el CSF-E a través de su composición apolipoproteíca pueda ser la base de una estrategia terapéutica basada en mecanismos de neuroprotección. El mecanismo a través del cual Apo B ejerce esta actividad y la relación de otras apolipoproteínas con el control del estrés oxidativo, nos lleva a pensar que el posible mecanismo de actuación de Apo B sería en base a su influencia sobre el proceso de estrés oxidativo, aunque la confirmación de este mecanismo de acción requiere de estudios complementarios que se escapan del ámbito de trabajo de esta tesis doctoral. Por lo tanto podemos concluir que la identificación de los factores específicos del CSF-E implicados en los diferentes procesos regulados por éste, es imprescindible para el futuro desarrollo del CSF-E como herramienta terapéutica.