Bioingeniería de tejidosdesarrollo de complejos células madre-biopolímeros para la reconstrucción de la superficie ocular

Resum

INTRODUCCIÓN / JUSTIFICACIÓN Según la Organización Mundial de la Salud, las enfermedades corneales son la segunda causa de pérdida de visión después de las cataratas, afectando a más de 10 millones de personas en todo el mundo. Entre éstas, se ha calculado que la deficiencia de células madre corneales constituiría la causa de aproximadamente el 50-70% de los casos. El trasplante de córnea se considera el método más efectivo para el tratamiento de la ceguera corneal cuando es ésta la única estructura ocular que se encuentra afectada. Sin embargo, cuando el limbo esclero-corneal se encuentra dañado de tal forma que se produce una deficiencia o ausencia de células madre en su epitelio, el trasplante de córnea fracasa ya que no existe la posibilidad de regenerar el epitelio del botón donante una vez que éste se ha agotado. Teniendo en cuenta que el síndrome de insuficiencia límbica se define como la pérdida o disfunción de las células madre de epitelio limbar, un tratamiento eficaz de esta patología requiere del reemplazo y/o aprovisionamiento de las mismas mediante el trasplante de células madre de epitelio limbar sanas a la superficie ocular enferma del paciente afectado. Para ello, además de una fuente celular, es necesario un soporte/sustrato donde, en primer lugar, poder llevar a cabo la expansión in vitro de las células y, posteriormente, el trasplante de las mismas al ojo dañado. La membrana amniótica humana y/o la fibrina son, a día de hoy, los sustratos más comúnmente utilizados en la práctica clínica para la expansión y posterior trasplante de células madre de epitelio limbar. Sin embargo, dada su naturaleza biológica, la utilización de este tipo de sustratos presenta una serie de problemas asociados que conllevan que la estandarización y la traslación de esta tecnología a un entorno industrial se planteen como un reto dificultoso y/o inabordable. La utilización de un sustrato polimérico sintético, en lugar de uno biológico, para la expansión de células madre de epitelio limbar conllevaría ventajas tales como la posibilidad de modular y optimizar sus características ópticas, topográficas y físico-químicas para su utilización en una aplicación ocular, además de lograr sortear las limitaciones propias de cualquier material biológico como la falta de reproducibilidad y los consabidos problemas de escasez de donantes y bioseguridad (riesgos de transmisión de enfermedades infecciosas y de rechazo inmunológico). Por las razones anteriormente mencionadas, en la actualidad se están comenzando a estudiar distintos tipos de biomateriales sintéticos como potenciales sustratos para el cultivo y posterior trasplante de células madre a la superficie ocular. Sin embargo, para favorecer la proliferación y posterior adhesión de las células al sustrato, en la mayoría de los estudios hasta ahora publicados las células son previamente cultivadas sobre fibroblastos murinos 3T3, lo que tiene como consecuencia que la bioseguridad del complejo formado por el polímero más las células se vea en su conjunto finalmente comprometida. En concordancia con esta corriente dirigida a la búsqueda de alternativas a los sustratos biológicos actualmente más utilizados, el presente trabajo pretende encontrar nuevos sustratos celulares basados en polímeros naturales y/o sintéticos para el cultivo y posterior trasplante de células madre a la superficie ocular dañada por el síndrome de insuficiencia límbica. Además, puesto que se sabe que el uso de aditivos de origen animal en las composiciones de los medios de cultivo utilizados para la expansión celular puede comprometer el éxito del trasplante, en este trabajo se pretende evitar en todo momento el uso de este tipo de suplementos así como prescindir de la utilización de fibroblastos murinos 3T3 para favorecer el crecimiento inicial del cultivo celular. Con este fin, los sustratos poliméricos candidatos se tratarán de funcionalizar mediante la inclusión en su composición y/o en su superficie de señales (proteínas o péptidos) que favorezcan la adhesión de las células al sustrato. HIPÓTESIS En conjunto, este trabajo pretende desarrollar, mediante técnicas de ingeniería de tejidos, complejos células madre-biopolímeros utilizando sustratos biopoliméricos que permitan una adecuada expansión y mantenimiento in vitro de las células madre de epitelio limbar, para su posterior trasplante a la superficie ocular dañada por el síndrome de insuficiencia límbica. El trabajo incluido en esta memoria de Tesis se ha llevado a cabo en el marco de un proyecto intramural del Centro de Investigación Biomédica en Red en Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina (CIBER-BBN) en colaboración con cinco grupos de investigación expertos en biomateriales, los cuales han sido los encargados del desarrollo y la síntesis de los diferentes biopolímeros utilizados: - Grupo de Biomateriales del Instituto de Ciencia y Tecnología de los Polímeros del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (ICTP-CSIC), dirigido por el Dr. Julio San Román del Barrio. - Grupo de Investigación en Biomateriales, Biomecánica e Ingeniería de Tejidos del Instituto de Bioingeniería de Cataluña (GBBIT-IBEC), dirigido por el Dr. Josep A. Planell Estany. - Grupo de Nanobioingeniería del Instituto de Bioingeniería de Cataluña (NANOMED-IBEC), dirigido por el Dr. Josep Samitier Martí. - Grupo de Investigación en Ingería Tisular de la Unidad de Salud (ITUS) de TECNALIA, dirigido por la Dra. Isabel Obieta Vilallonga. - Grupo de Biomateriales, Biomimética y Nanobiotecnología de la Universidad de Valladolid (BIOFORGE-UVa), dirigido por el Dr. José Carlos Rodríguez Cabello. CONTENIDO DE LA INVESTIGACIÓN Para realizar este trabajo se llevó a cabo el diseño y fabricación de diferentes biomateriales basados en quitosano, gelatina, colágeno, ácido poliláctico y elastina con propiedades mecánicas y de manejabilidad adecuadas para poder ser utilizados como sustratos para el cultivo y posterior trasplante de células madre a una superficie ocular dañada. Tras la fabricación de los biomateriales por cada uno de los grupos de investigación anteriormente citados, se llevó a cabo una selección de los biomateriales más adecuados para el cultivo celular en base a la realización de estudios de biocompatibilidad y caracterización celular in vitro con una línea celular de epitelio corneal humano, debido a la escasez y la dificultad de obtención de cultivos primarios de epitelio limbar humano. Se observó que biopolímeros basados en quitosano y gelatina, IF-13 y colágeno, así como polímeros tipo elastina, resultaron biocompatibles con la línea celular de epitelio corneal humano HCE, por lo que pudieron ser utilizados para realizar estudios in vitro con este tipo celular. Una vez seleccionados los biomateriales más adecuados, se llevó a cabo el aislamiento de células madre derivadas del nicho limbar sobre los biomateriales seleccionados, a partir de botones corneo-limbo-esclerales procedentes de donantes cadáver proporcionados por el Banco de ojos Barraquer (Barcelona). Y tras el cultivo celular de los biomateriales, se caracterizó la población celular obtenida con el fin de comprobar la existencia de células madre en el cultivo celular obtenido sobra cada uno de los biomateriales. Se observó que era posible establecer el cultivo de una población de células de epitelio limbar humano rica en células madre indiferenciadas sobre sustratos poliméricos consistentes en membranas de quitosano y gelatina en proporción 20:80 y polímeros IF-13-BP funcionalizados con colágeno IV. Por lo tanto, se puede afirmar que estos sustratos resultaron idóneos para el cultivo y el mantenimiento del fenotipo indiferenciado de células madre de epitelio limbar humano, pudiendo utilizarse como sustratos para experimentación in vitro con este tipo celular. Además, esto ha podido realizarse evitando el uso de productos de origen animal y/o potencialmente nocivos. Por último, se realizó un estudio preliminar de adaptación, posibilidad de sutura y tolerancia de los biomateriales in vivo, en la superficie ocular de un conejo sano. En este caso, a pesar de los buenos resultados obtenidos en cuanto al cultivo y mantenimiento del estado indiferenciado de las células, los resultados de adaptabilidad en el caso del ácido poliláctico, y de mala tolerancia por parte del animal en el caso de los polímeros basados en quitosano y quitosano gelatina, hicieron descartar este tipo de biomateriales como sustratos para el trasplante de células madre a la superficie ocular. CONCLUSIONES Tras el estudio, se ha confirmado la posibilidad de establecer el cultivo de una población rica en células madre de epitelio limbar indiferenciadas sobre sustratos poliméricos consistentes en membranas de quitosano y gelatina y polímeros IF-13-BP funcionalizados con colágeno IV. Además, a pesar de que los materiales mencionados anteriormente no resultasen adecuados para su utilización in vivo, se ha abierto la posibilidad de mejorar sus propiedades mecánicas con el fin de mejorar sus características para su posible trasplante a la superficie ocular.