Heterogeneidad funcional de los depósitos de calcio del retículo endoplásmico y del aparato de golgi

Abstract

En esta Tesis se estudia la dinámica del calcio (Ca2+) en los principales depósitos intracelulares, retículo endoplásmico (RE) y aparato de Golgi (Go) en dos modelos celulares humanos, las células HEK293 y las HeLa, y su contribución a la génesis de señales de Ca2+ citosólico. Se han diseñado y construido tres nuevas sondas de Ca2+ derivadas de la fotoproteína aequorina con secuencias de direccionalidad que permiten hacer medidas en diferentes microdominios del Go y el RE de las células vivas, tanto por fotoluminiscencia como por fluorescencia. En el RE de las células HEK293 hemos podido demostrar la coexistencia de dos ATPasas de Ca2+, SERCA2b y SERCA3d. Esta última es responsable de un componente atípico de la captación de Ca2+ en RE, que es resistente a la tert-butilhidroquinona (TBH) y cuya función es desconocida. El Inositol 1, 4, 5-trifosfato (IP3) es capaz de movilizar el Ca2+ de este compartimento. Las células HeLa expresan SERCA3 muy escasamente (20 veces menos que las HEK293) y tampoco muestran captación de Ca2+ resistente a TBH en su RE, de modo que el depósito de Ca2+ del RE es homogéneo en las células HeLa. La captación de Ca2+ resistente a TBH se induce por sobreexpresión de SERCA3d en las células HeLa. El Go como reservorio de Ca2+ se ha estudiado con especial detalle utilizando sondas dirigidas específicamente a las zonas cis (cGo) y trans (tGo) del mismo. Estos compartimentos difieren por su sensibilidad a la tapsigargina y a la TBH y por la expresión de la ATPasa de Ca2+ de la vía secretora (SPCA1). El cGo es un compartimento homogéneo, capaz de acumular Ca2+ a concentraciones próximas a 150 µM vía SERCA y con muy poca expresión funcional de la SPCA. El tGo está compuesto por dos subcompartimentos, tGo1 y tGo2. El tGo2 que supone el 75 % de tGo, lo consideramos un compartimento de transición con muy poca expresión de SPCA y un nivel de Ca2+ relativamente bajo (40 µM). El tGo1 supone el 25 % de tGo, posee actividad SPCA y acumula Ca2+ a gradientes cercanos a 200 µM. La matriz de tGo1 no tiene continuidad difusional con tGo2, por lo que pensamos que podría estar compuesto por vesículas situadas en el extremo más trans del Go. La captación de Ca2+ por tGo1 es de mucha mayor afinidad que la del RE, cGo y tGo2 por lo que este compartimento mantiene alto su contenido de Ca2+ incluso cuando baja el Ca2+ citosólico a niveles que ocasionan el vaciamiento de los otros depósitos intracelulares. El mantenimiento del alto contenido de Ca2+ en este compartimento parece esencial para el procesamiento de proteínas en el Go.