Métodos de modificación génica dirigida en células humanas y su aplicación en el síndrome de wiskott-aldrich

Resum

Introducción. La modificación génica dirigida es un proceso mediante el cual, un gen defectuoso es sustituido por uno normal, lo que requiere la participación de la maquinaria celular de reparación mediante recombinación homóloga (RH). La RH es un mecanismo que en células de mamíferos ocurre a muy baja frecuencia, motivo por el cual nos hemos planteado estudiar diferentes condiciones experimentales que mejoren dicha frecuencia. Contenido de la investigación. Como método de estudio de frecuencia de RH, se generó una línea celular reportera HCT116-RCL, en la que se introdujo una copia del gen EGFP truncado en el extremo 3¿ (no funcional). En paralelo, se generó un virus adenoasociado recombinante (rAAV), AAV-¿5-EGFP-donor, que contenía el gen EGFP truncado en el extremo 5¿. Mediante la utilización de esta línea celular y del rAAV y de una pareja de nucleasas TALEs, se estudió una proteína de fusión ScRad52 y una librería de 84 siRNAs dirigidos frente a genes implicados en la vía de recombinación no homóloga (NHEJ), así como frente a otros de funciones diferentes. También se llevaron a cabo tratamientos combinados de algunos siRNAs, para estudiar un posible efecto sinérgico en las mezclas. Se observó que, tanto ScRad52, como 12 de estos siRNAs, y algunas de las combinaciones fueron capaces de incrementar significativamente la frecuencia de RH en la célula reportera, sin alterar la viabilidad de manera significativa. Una vez determinadas las mejores condiciones para poder aumentar la frecuencia de RH, estas condiciones se aplicaron para la generación de una línea celular knockout para el gen WAS (Wiskott-Aldrich Syndrome) en fibroblastos primarios. Para ello se generó un rAAV que contenía la mutación en WAS que se quería introducir en el genoma celular. Estos fibroblastos KO, se asemejan a los fibroblastos de pacientes enfermos de Síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS). WAS es una inmunodeficiencia primaria severa de herencia recesiva, ligada al cromosoma X, caracterizada por la presencia de infecciones recurrentes, eczema y trombocitopenia. Es así que, una vez obtenida la célula KO, se procedió a la corrección de la mutación en dichas células, esta vez, utilizando un rAAV que contenía una copia wild type del gen. En paralelo, se construyó una línea KO en la línea celular T Jurkat utilizando el sistema de nickasas CRISPR/Cas9. Finalmente, los fibroblastos primarios cuya mutación fue corregida, y que por lo tanto, contienen una copia normal del gen WAS se transdiferenciaron eficientemente a células progenitoras hematopoyéticas (CD45+), comprobándose la expresión normal de la proteína WASp. Conclusiones. Se logró aumentar la frecuencia de RH mediante la utilización de un sistema línea celular reportera - virus adenoasociado donante, en el cual se ensayaron una pareja de nucleasas TALENs, una proteína de fusión y una librería de siRNAs. Con las mejores condiciones encontradas, se realizó la modificación génica dirigida en el gen WAS, basándonos en técnicas de edición génica mediante RH. Se aplicó con éxito un protocolo para la transdiferenciación de fibroblastos primarios corregidos del defecto genético. Bibliografía. Adamson B, Smogorzewska A, Sigoillot FD, King RW, Elledge SJ. A genome-wide homologous recombination screen identifies the RNA-binding protein RBMX as a component of the DNA-damage response. Nature Cell Biology, 2012. 14, 318-28. Bibikova M, Carroll D, Segal DJ, Trautman JK, Smith J, et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Molecular and cell biology, 2001. 21, 289-97. Daya S, Berns KI. Gene Therapy Using Adeno-Associated Virus Vectors. Clinical Microbiology Reviews, 2008. 21, 583-593. Di Primio C, Galli A, Cervelli T, Zoppé M, Rainaldi G. Potentiation of gene targeting in human cells by expression of Saccharomyces cerevisiae Rad52. Nucleic acids research, 2005. 33, 4639-48. Gaj T, Gersbach CA, Barbas III CF. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology 2013. 31, 397-405. Massaad MJ, Ramesh N, Geha RS. Wiskott-Aldrich syndrome: a comprehensive review. Annals of the New York Academy of Sciences, 2013. 1285, 26-43. Schmid-Burgk JL, Schmidt T, Kaiser V, Höning K and Hornung V. A ligation-independent cloning technique for high-throughput assembly of transcription activator¿like effector genes. Nature Biotechnology 2013. 31, 76-81. S¿abicki M, Theis M, Krastev DB, Samsonov S, Mundwiller E, et al. A genome-scale DNA repair RNAi screen identifies SPF48 as a novel gene associates with hereditary spastic paraplegia. PLos Biology, 2010. 8, e1000408. Szabo E, Rampalli S, Risueño RM, Schnerch A, Mitchell R, et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature, 2010. 468, 521-6. Vasileva A, Jessberger R. Precise hit: adeno-associated virus in gene targeting. Nature reviews Microbiology, 2005. 837-847.