Modulación de la entrada capacitativa y de la distribución del calcio subcelular por stim, orai y serca

Resumen

La señalización por Ca2+ se modula esencialmente por parámetros espacio-temporales. Así pues, la interpretación dinámica de las señales de Ca2+ requiere conocer los cambios que suceden, simultáneamente, en diferentes dominios subcelulares, para lo cual es necesario disponer de las herramientas adecuadas. Entre la diversidad de sondas disponibles, la aequorina aporta una resolución espacial óptima para la detección de los microdominios de Ca2+ en células vivas. La primera parte de esta Tesis está dedicada al diseño y desarrollo de una metodología que permita ejecutar registros simultáneos de Ca2+ en los distintos orgánulos mediante la adquisición de bioluminiscencia en poblaciones celulares. El objetivo es monitorizar, en tiempo real y de manera simultánea los cambios de Ca2+ en cada compartimento. En una segunda fase, se aborda un asunto candente en el estudio de la homeostasis celular del calcio, la entrada capacitativa. Este mecanismo resulta enormemente relevante por su amplia presencia en células no excitables y su implicación en la homeostasis del Ca2+, así como en la capacidad celular para sostener el desencadenamiento y la reversión de la señal. Estos aspectos se estudian mediante: i. Experimentos de pérdida de función, usando técnicas de silenciamiento de STIM1 con siRNA, plásmidos que expresan la secuencia de shRNA y vectores víricos portadores del shRNA. ii. Experimentos de ganancia de función mediante la sobreexpresión de STIM1 y Orai1. En este proyecto, las aequorinas de fusión desarrolladas en el apartado anterior se emplean para permitir registros subcelulares de la dinámica del Ca2+ subyacente al mecanismo capacitativo. Otras técnicas como el análisis de las interacciones proteína-proteína por FRET o inmunoprecipitación, sirven para profundizar en su descripción, las interacciones entre sus protagonistas y las consecuencias funcionales. En el estudio se incluye un tercer elemento, la SERCA, responsable del bombeo final del Ca2+ desde el citosol al interior del RE. Los resultados que se extraen de este trabajo, nos permiten determinar la interrelación de este mecanismo con otros elementos de la señalización por Ca2+ y diseñar un modelo funcional más detallado que complementa el modelo actual de entrada capacitativa mediado por STIM y Orai.