Controlled formation of nanostructures based on elastin-like recombinamers

Laburpena

Abstract Synergistic combination between multiple and outstanding properties stemmed from different materials, so that they work cooperatively, is the key for improved functional performance and applications. In this regard, it is important to understand the properties of each material separately, thus guiding us to the best combination of these materials at the atomic and macroscopic dimensions. Mimicking the assembling ways of the biological hybrid structures is one of those effective approaches for generating new nanohybrid materials with a pre-programmed activity and high functional performance which is known as the biomimetic approach. The present work combines different properties stemmed from three materials: elastin-like recombinamers (ELRs) inspired by natural elastin, calcium phosphate and carbon nanotubes (CNTs). Therefore, different mechanisms have been discussed: the self-assembly and organization of ELRs, biomimetic mineralization and actuating at the nanoscale. Understanding of such fundamental processes aims to construct new ELRs and develop new functional materials, thus transferring new ideas to artificial materials and different applications. In this regard, a literature survey has been presented in the first chapter. In this chapter, the synthesis strategies of ELRs at the gene level and their properties, the calcium phosphate formation through self-assembly properties of amphiphilic molecules and the CNTs dispersion in solutions via grafting their walls by organic molecules have been introduced. The second chapter explains the synthesis method of ELRs using recombinant DNA technology. Moreover, the formation methods of calcium phosphate/ELRs hybrid structures and the synthesis method of the ELRs chemical hydrogels have been explained. Also, the grafting method of CNTs with the ELRs chains has been illustrated. Respectively, several physical-chemical characterization methods have been presented. Findings of this research work have been presented and discussed in the third chapter that comprises six sections. The first one explores the self-assembly mechanism of the ELRs chains and their organization into physical hydrogel. In this regard, an amphiphilic, heat-sensitive, elastin-like co-recombinamer (ELcoRs) that exhibits different self-assembled concentration-dependent morphologies in aqueous solution has been studied. The spherical micelles observed at low concentration turn into small cylindrical micelles as the concentration increases. Further increases in concentration give rise to a lyotropic hydrogel. This hydrogel is formed by organization of the ELcoR molecules into fibrillar structures exhibiting hexagonal packing. A simplified model to explain these concentration-dependent morphologies has been proposed. In section two, the SNA15 epitopes, inspired by the salivary protein statherin that has high affinity to calcium phosphate formations, were combined to an ELcoR using recombinant DNA technology. Three and six epitopes were introduced at the hydrophilic end of this ELcoR. In sections three and four, the combination of the self-assembling properties of several thermally-sensitive amphiphilic elastin-like multiblock recombinamers with the capacity of calcium phosphate binding of the SNA15 epitopes were studied. To our best knowledge, up to now, there was no clear evidence about the fundamental aspects such as the influence of SNA15 within the ELRs, and how the distribution of the SNA15 domains along the ELR backbone could affect the calcium phosphate formation. In this regard, the interaction between calcium and phosphate ions was examined in the presence of hybrid elastin-like statherin recombinamers (ELR- SNA15). One of these recombinamers comprised a simple amphiphilic diblock in which the SNA15 epitopes were combined to the hydrophilic end. Incorporation of SNA15 epitopes has obvious consequences. Light scattering has demonstrated that the ELcoR micellar structure is affected, since the average size and the aggregation number are changed. Also, the influence of its micellar structure on hydroxyapatite (HA) nucleation and crystallization has been studied. This recombinamer controls the transformation of amorphous calcium phosphate (ACP) into fibre-like HA. In the other recombinamer that cannot form a micellar structure, the SNA15 domains are distributed along its monomer chain where the hydrophilic blocks being distributed amongst the hydrophobic ones. In this case, the resulting nanohybrid ACP/recombinamer organises into neuron-like structures. Thus, combining the amphiphilic ELRs with the SNA15 functionality is a powerful means to tune the formation of different complex calcium phosphate nanostructures. In section five, the biomimetic mineralization of hydrogels, based on ELRs that have a fibrillar morphology, with calcium phosphate has been described. These hydrogels were prepared by crosslinking the recombinamer chains via Huisgen [2+3] cycloaddition. This work has demonstrated that it is possible to control and modify the mineralization process even in the restricted conditions of a hydrogel interior that has shown capabilities for specific and efficient HA nucleation and binding. In the last section (section six), ELRs thermal responsive behavior has been exploited for paving the way towards nanoactuators. To our best knowledge, this is the first time that the ELRs monomer chains have been attached to the surface of CNTs that serve as nanotemplates. It has been found that CNTs are less bundled in the formed CNT-ELR nanohybrid material obtained from more effective functionalization reaction. Moreover, this nanohybrid material has a morphology of a fibrillar structure. High resolution transmission electron microscopy (HRTEM) has showed that the CNT surface is covered with a layer of ELR. Moreover, light scattering was used to determine the elongation of the ELRs chains as a function of temperature at nanoscale. It has been found that there are obvious differences between the hydrodynamic radius of ELR and the CNT-ELR. The gelation behavior of CNT-ELRs demonstrates the effective interactions between CNTs and ELR chains due to the suitable surface modification. Finally, the last chapter concludes the findings and recommendations for future works that can be inferred from the hierarchy produced in the present PhD thesis. Resumen La sinergia entre materiales, de modo que actúan de manera cooperativa, puede dar lugar a la combinación de propiedades significativas que mejoran tanto su funcionamiento como las aplicaciones. Con este objetivo, es importante comprender las propiedades de cada componente por separado, obteniendo así la mejor manera de realizar el ensamblado a escala atómica y macroscópica. Éste es el parámetro clave para generar materiales con una actividad pre-programada. La estrategia bio-mimética consiste en la imitación de los modos de ensamblado de estructuras biológicas híbridas. El presente trabajo combina diferentes propiedades que proceden de tres materiales: recombinámeros de tipo elastina (ELRs) inspirados en la elastina natural, fosfato de calcio y nanotubos de carbono (CNTs). Por consiguiente, se correlacionan diferentes mecanismos: autoensamblado y organización de los ELRs, mineralización bio-mimética y actuación en el rango de la nanoescala. Las mejoras en la comprensión de tales procesos fundamentales permiten la construcción de nuevos ELRs y desarrollar materiales funcionales novedosos, transfiriendo nuevas ideas a aplicaciones biomédicas y materiales sintéticos. El primer capítulo de esta Tesis corresponde a una revisión bibliográfica en esta área de investigación. Se han introducido las estrategias de síntesis de los ELRs a nivel de gen y sus propiedades, la formación del fosfato de calcio via el autoensamblado de moléculas de tipo anfifílico y la dispersión de CNTs en soluciones a través del injerto de moléculas orgánicas en las paredes de dichos CNTs. En el segundo capítulo se explican los procedimientos de síntesis de los ELRs usando la tecnología de ADN recombinante. También, se presentan la formación de estructuras híbridas de fosfato de calcio/ELR, así como hidrogeles químicos de ELRs. Además, se ha ilustrado el método de injerto de CNTs con ELRs. Por ello, se han presentado varios métodos de caracterización físico-químicos. Los resultados de esta investigación se presentan y discuten en el capítulo 3, que consta de 6 secciones. En la primera se explora el mecanismo de autoensamblado y organización en hidrogel de tipo físico. Para ello se ha estudiado un co-recombinámero de tipo elastina (ELcoRs), anfifílico y sensible a la temperatura, que presenta diferentes morfologías de autoensamblado dependientes de la concentración en disolución acuosa. Las micelas esféricas observadas a baja concentración se transforman en pequeñas micelas cilíndricas cuando la concentración aumenta. Incrementos adicionales en la concentración dan lugar a un gel liotrópico formado por la organización de moléculas del co-recombinámero en estructuras fibrilares con empaquetamiento hexagonal. Se ha propuesto un modelo simplificado para explicar estas morfologías dependientes de la concentración. En la sección 2, epítopos de SNA15, inspirados en la proteína salivar esteaterina que tiene una alta afinidad por las formaciones de fosfato de calcio, se combinaron con un co-recombinámero ELR mediante la tecnología de ADN recombinante. En las secciones 3 y 4, se ha estudiado la combinación de las propiedades de autoensamblado de varios recombinámeros multibloque de tipo elastina, anfifílicos y sensibles a la temperatura, con la capacidad del fosfato de calcio de enlazar epítopos de SNA15. Hasta el momento, no existe en la bibliografía una evidencia clara acerca de aspectos fundamentales, tales como la influencia de los epítopos de SNA15 dentro de los ELRs o cómo afecta a la formación del fosfato de calcio la distribución de los dominios de SNA15 a lo largo de la cadena del polímero. A este respecto, se examinó la interacción entre los iones calcio y fosfato en presencia de dos recombinámeros híbridos. Uno de ellos corresponde a un dibloque anfifílico simple en el cual los epítopos de SNA15 se combinaron con el extremo hidrofílico. La incorporación de estos epítopos tuvo consecuencias evidentes. La dispersión de luz demostró que la estructura micelar está afectada, habiendo cambiado tanto el tamaño medio como el número de agregación. También se estudió la influencia de su estructura micelar sobre la nucleación y cristalización de la hidroxiapatita (HA). Este recombinámero controla la transformación del fosfato de calcio amorfo (ACP) en HA con morfología fibrosa. En el otro recombinámero (que no forma estructura micelar), los dominios SNA15 están distribuidos a lo largo de la cadena monomérica donde los bloques hidrofílicos se distribuyen entre los bloques hidrofóbicos. En este caso, el recombinámero híbrido resultante, ACP/ELR, se organiza dando lugar a estructuras con morfología neuronal. Así, la combinación de ELRs anfifílicos con la funcionalidad de los epítopos de SNA15 proporciona una estrategia potente que permite sintonizar la formación de diferentes nanoestructuras complejas de fosfato de calcio. En la sección 5, se ha descrito la mineralización biomimética de hidrogeles con una morfología fibrilar basados en ELRs con fosfato de calcio. Se prepararon mediante entrecruzamiento de las cadenas de los recombinámeros a través de cicloadición de Huisgen. Este trabajo demuestra que es posible controlar y modificar el proceso de mineralización incluso en las condiciones restrictivas existentes en el interior de un hidrogel, el cual muestra capacidad de nucleación y enlace específico y eficiente de la HA. En la sección 6, la respuesta térmica de los ELRs se ha explotado para preparar el camino hacia la realización de nanoactuadores. Hasta donde sabemos, se trata de la primera vez que cadenas monoméricas de ELRs se han conectado sobre la superficie de CNTs, los cuales se usan a modo de nanoplantilla. Se ha encontrado que los CNTs están menos empaquetados en las muestras obtenidas mediante una reacción de funcionalización efectiva. Además, el material nanohíbrido formado, CNT-ELR, tiene una morfología fibrilar. Gráficos de microscopía electrónica de transmisión con alta resolución muestran que la superficie de los CNT está cubierta con una capa de ELR, la cual es debida a los recombinámeros conectados. La técnica de dispersión de luz nos permitió determinar que las cadenas de ELR presentan elongación en función de la temperatura a escala nanoscópica. Se han encontrado diferencias evidentes en el radio hidrodinámico del ELR y del CNT-ELR. El comportamiento de gelificación de los CNT-ELRs muestra buenas interacciones entre los CNTs y las cadenas de ELR debido a la adecuada modificación de la superficie. Finalmente, el último capítulo concluí los resultados experimentales, junto con recomendaciones para futuros trabajos que se deducen de la estructura jerárquica aportada en la presente Tesis Doctoral.