Bioengineered dynamic systems based on elastin-like recombinamers

Résumé

La ingeniería tisular y la medicina regenerativa son campos interdisciplinares que tienen como objetivo desarrollar sustitutos biológicos que restauren, mantengan o mejoren la función de un tejido o de un órgano perdida por lesión o enfermedad. Los biomateriales utilizados en aplicaciones biomédicas persiguen alcanzar características esenciales que promuevan la nueva morfogénesis tisular creando un entorno favorable para el crecimiento celular, así como las propiedades físicas y químicas adecuadas requeridas para un tejido determinado. En décadas pasadas, se han encontrado varios obstáculos para seleccionar biomateriales funcionales que imiten la matriz extracelular natural (MEC). Por ejemplo, algunos de los polímeros sintéticos a menudo son biocompatibles, pero carecen de interacción con las células y el crecimiento del tejido, lo que ha llevado a la necesidad de modificar muchos de estos materiales con secuencias y factores bioactivos. A la inversa, los polímeros naturales derivados de proteínas de la matriz extracelular ofrecen la ventaja de la señalización biológica, pero pueden ser antigénicas y sus propiedades físicas son más difíciles de modular que en los polímeros sintéticos. La biodegradación es una característica crucial en los implantes biomédicos y su modulación ha sido ampliamente estudiada. Presentar un tiempo de degradación sincronizado con la formación de los nuevos tejidos es un objetivo altamente perseguido. La tasa de degradación está influenciada por muchas características de los polímeros, incluida la morfología y la orientación de la cadena, la cristalinidad inicial, el peso molecular, la presencia de monómeros y oligómeros residuales y la pureza. Existen varios métodos para cambiar y controlar la velocidad de degradación de los polímeros sintéticos y naturales, como la copolimerización, la mezcla, los aditivos y la irradiación, pero estos métodos presentan diferentes inconvenientes, como el cambio en las propiedades mecánicas, la pobre biocompatibilidad y el retraso en la bioabsorción. Debido a estos inconvenientes, puede ser útil producir biomateriales que sean sensibles a ciertos enzimas que se valgan de la respuesta inflamatoria que se produce por la propia lesión o introducción del implante. Los avances en ingeniería genética han facilitado la producción de proteínas modificadas que abarcan una amplia gama de propiedades y funcionalidades, como la adhesión celular, la señalización celular, la elasticidad y la biodegradabilidad. Actualmente, los recombinamers de tipo elastina (ELR) muestran propiedades sobresalientes para su aplicación en regeneración de tejidos. Los ELR son polipéptidos artificiales con un alto contenido en elastina que los convirtió en materiales capaces de imitar la ECM. El más comúnmente utilizado es el penta-péptido VPGXG, donde X representa cualquier aminoácido excepto la L-prolina. Como ya se ha mencionado se sintetizan mediante tecnología recombinante que permite no sólo un control absoluto sobre su composición de aminoácidos y funcionalidades de la proteína final, pudiendo incluir epítopos específicos, tales como secuencias de adhesión, dianas de degradación, péptidos antimicrobianos, etc., sino también de propiedades como su peso molecular. Tienen interesantes propiedades mecánicas que van desde los elastómeros ideales hasta el plástico que permiten, por lo tanto, un esfuerzo mecánico repetitivo y confieren resistencia mecánica a través de un mecanismo separado que soporta varias funciones del tejido. Por último, son extremadamente biocompatibles debido a su composición aminoácidica que implica la repetición de secuencias basadas en las secuencias encontradas en la elastina de los mamíferos. En el primer estudio de esta tesis se emplearon dos ELRs con una bioactividad complementaria (CC-RGD y CCC-REDV), las cisteínas están incluidas en la región amino terminal, para desarrollar un sistema 2D en el que la adhesión celular selectiva está controlada espacialmente para su posterior aplicación en la tecnología de biosensores como dispositivos de diagnóstico o en la aplicación de ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Específicamente, en este estudio, las superficies modelo de oro se funcionalizaron con diferentes porcentajes de dos ELRs (CC-RGD y CCC-REDV), lo que demuestra que una composición óptima de 75% CCC-REDV y 25% CC-RGD conduce a una adhesión selectiva de células endoteliales en un sistema de co-cultivo. Luego, una vez que se funcionalizó toda la superficie con 100% de CC-RGD, se limpiaron áreas específicas mediante ablación con láser sin interferir en las propiedades topográficas, hidrófobas y mecánicas de las superficies. Estas áreas se funcionalizaron con un 75% de CCC-REDV y un 25% de CC-RGD y después de los estudios in vitro, se observó una distribución bien definida de células HUVEC y HFF1, es decir, un control espacial selectivo sobre la adhesión de las células HUVEC. Estos hallazgos sugieren un enfoque innovador para la generación de biosensores y / o andamios que requieren la organización espacial y temporal de las células. A continuación, el segundo estudio de esta tesis consiste en la mejora de la actividad angiogénica de los hidrogeles basados en ELR cuando se pega químicamente un pequeño péptido llamado QK que mima el factor de acrecimiento VEGF. Además de las secuencias de adhesión celular (RGD y REDV), un ELR utilizado en este trabajo presenta un sitio proteolítico (VGVAPG) que pertenece a la enzima elastasa. La actividad angiogénica de estos hidrogeles se estudió in vitro, demostrando que no altera las propiedades mecánicas y morfológicas de los ELR, sino la actividad biológica, como la adhesión y proliferación celular. Cuando se inyectó in vivo, se observó una mejor formación de microvasculatura que facilita la perfusión y la conexión con el tejido circundante. Estos resultados mostraron que los hidrogeles basados en ELR-QK son construcciones diseñadas óptimas con una potencial actividad angiogénica que podría emplearse en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. El tercer estudio de esta tesis tiene como objetivo lo de controlar en tiempo y espacio la infiltración célular y la biodegradación en un sistema estructurado tridimensional (3D). Los ELR empleados en este trabajo, además de una secuencia de adhesión celular universal (RGD), contienen sitios proteolíticos que se degradan en respuesta al activador de plasminógeno uroquinasa (uPA) con diferente tasa de degradación (rápida y lenta). Aprovechando estas características, en este estudio se desarrolló un sistema 3D que consiste en discos de hidrogeles de tres capas, con una capa interna que contiene el componente de degradación rápida y las capas externas que contienen el ELR de degradación lenta. Esos discos se han implantado por vía subcutánea en ratones y su evolución se siguió a lo largo del tiempo. Como resultado del diseño y de la secuencia de infiltración celular programada, la capa interna se colonizó primero siguiendo un patrón de adentro hacia afuera. Estos resultados demostraron que el sistema basado en 3D-ELR podría aplicarse como un sustituto tisular para la aplicación biomédica que requiere una regeneración controlada y vascularización a lo largo del tiempo. En resumen, los estudios mostrados en esta Tesis brindan nuevos conocimientos sobre los hidrogeles basados en ELR que se utilizarán en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Específicamente, describe la importancia de la inclusión de varios epítopos en el esqueleto de la ELR, como por ejemplo secuencias de adhesión universales y específicas que influyen en el comportamiento celular. Además, el hidrogel basado en ELRs presenta mejores propiedades angiogénicas cuando un péptido mimético de VEGF llamado QK está pegado químicamente. Por otro lado, los ELRs con una tasa de degradación controlada podrían estar implicados en la construcción de estructuras biológicas complejas para su empleo en la regeneración de tejidos.