Análisis de la expresión de biomarcadores de inflamación en la superficie ocular asociado a síntomas de incomodidad ocular en usuarios de lentes de contacto

Resumen

La presente tesis se ha realizado en el Instituto de Oftalmobiología Aplicada (IOBA) de la Universidad de Valladolid (Valladolid, España) y ha sido dirigida por la Dra. María Jesús González García y la Dra. Amalia Enríquez de Salamanca Aladro. Además, parte de esta tesis ha sido realizada durante una estancia de tres meses en la School of Optometry and Vision Science de la University of New South Wales (UNSW) (Sídney, Australia) bajo la supervisión de la Dra. Maria Markoulli y el Profesor Eric Papas, lo que permite a esta tesis optar a la mención de “doctor internacional”. JUSTIFICACIÓN Se estima que uno de cada dos usuarios de lentes de contacto (LC) sufre síntomas de incomodidad con LC (CLD por sus siglas en inglés, Contact Lens Discomfort). Además, esta condición es la primera causa de abandono del uso de LC. La etiología de la CLD es aún desconocida, lo que la hace una condición difícil de predecir y de manejar. Por tanto, la CLD supone un importante impacto para fabricantes, clínicos y los propios usuarios. La sociedad Tear Film and Ocular Surface (TFOS) propuso algunas potenciales causas, incluyendo un estado inflamatorio de la superficie ocular. Esta tesis se ha dirigido a analizar la implicación de potenciales biomarcadores de inflamación y nocicepción en la CLD. Los resultados de esta tesis ampliarán el conocimiento del estado inflamatorio y nociceptivo molecular y celular de la superficie ocular de usuarios de LC que sufren CLD. Además, encontrar el apropiado biomarcador podría servir para mejorar la detección, predecir la aparición y/o mejorar el manejo clínico de la CLD. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS La hipótesis de esta tesis es que la causa de la CLD es un estado inflamatorio subclínico subyacente y/o una alteración de los mecanismos nociceptivos de la superficie ocular. Además, para responder a esta hipótesis, se establecieron los objetivos que se presentan a continuación. El objetivo 1 fue estudiar el efecto del uso de LC hidrofílicas sobre la superficie ocular y evaluar si existe alguna alteración clínica asociada con la CLD. El objetivo 2 fue estudiar si existe alguna relación entre la morfología de las fibras nerviosas y la densidad de células dendríticas del plexo nervioso sub-basal de la córnea con determinadas propiedades de las LC hidrofílicas y la CLD. El objetivo 3 fue investigar el efecto del uso de LC hidrofílicas en la morfología de la conjuntiva tarsal visualizada por medio de microscopía confocal in vivo y su posible asociación con los síntomas de incomodidad ocular. El objetivo 4 fue analizar si el uso de LC hidrofílicas y la CLD están asociados con cambios en los niveles en lágrima de mediadores inflamatorios y sustancia P. El objetivo 5 fue identificar alteraciones en la expresión génica de células conjuntivales relacionada con dolor neuropático e inflamatorio asociado al uso de LC hidrofílicas y la CLD. INTRODUCCIÓN La CLD se ha definido como “una afección caracterizada por sensaciones oculares adversas, episódicas o persistentes, relacionadas con el uso de LC, ya sea con o sin alteración de la visión, resultado de la reducción de compatibilidad entre la LC y el entorno ocular, que puede llevar a la disminución del tiempo de uso y al abandono del uso de lentes de contacto”. El uso de LC se ha asociado con diversas alteraciones clínicas en diferentes estructuras de la superficie ocular, incluyendo la película lagrimal, la córnea, la conjuntiva y los párpados. Sin embargo, estas alteraciones no están bien relacionadas con la CLD. Además, también se han encontrado alterados algunos signos que están relacionados con la inflamación de la superficie ocular en usuarios de LC, como la densidad de células dendríticas en la córnea o los niveles de mediadores inflamatorios en lágrima. De hecho, son muchas las publicaciones científicas que han analizado el efecto del uso de LC en los niveles de mediadores inflamatorios en lágrima, pero la variedad de materiales, modalidades de uso y sistemas de mantenimiento, entre otros factores, hacen difícil entender el efecto real de las LC en estos mediadores. A fin de profundizar en este tema, se llevó a cabo una revisión bibliográfica a través de una búsqueda en PubMed de trabajos de investigación originales que analizaran mediadores inflamatorios en lágrima de usuarios de LC. Se incluyeron 43 artículos, de 1990 a 2019. En estos trabajos se ha descrito que el uso de LC hidrofílicas, rígidas y diseños especiales para córneas irregulares en pacientes con queratocono (LC con diseño cónico, hibridas, piggyback y LC esclerales) altera la concentración de diversos mediadores en lágrima. Además, parece haber un efecto del tiempo de uso, la modalidad de reemplazo, los materiales y diseños, y las soluciones de mantenimiento usadas. Respecto a la CLD, su relación con mediadores inflamatorios no es clara. Sin embargo, algunas patologías asociadas con el uso de LC, como conjuntivitis papilar gigante, ojo rojo inducido por el uso de LC, úlcera periférica y queratitis por acanthamoeba se han relacionado con la expresión de ciertos mediadores inflamatorios, los que podrían servir como potenciales biomarcadores. En resumen, existe evidencia que sugiere que diferentes aspectos del uso de LC alteran el perfil de mediadores inflamatorios en lágrima. MATERIALES Y MÉTODOS Esta tesis incluye dos proyectos de investigación principales: uno llevado a cabo en el IOBA de la Universidad de Valladolid, el cual ha dado lugar a cuatro trabajos de investigación, y otro proyecto llevado a cabo en la School of Optometry and Vision Science de la UNSW, el cual ha dado lugar a un trabajo de investigación. Proyecto IOBA El proyecto llevado a cabo en el IOBA incluyó 20 no usuarios y 60 usuarios de LC hidrofílicas, los cuales fueron divididos en 30 sintomáticos (ULCS) y 30 asintomáticos (ULCA) usando el cuestionario Contact Lens Dry Eye Questionnaire (CLDEQ)-versión corta. Todos los participantes acudieron a una visita de inclusión que sirvió además como visita inicial. En esta visita los sujetos completaron el cuestionario Ocular Surface Disease Index (OSDI) y los usuarios de LC también completaron los cuestionarios CLDEQ-versión corta y CLDEQ-8. Además, se les realizaron una serie de pruebas clínicas: agudeza visual, osmolaridad lagrimal, tiempo de ruptura lagrimal con fluoresceína (FBUT por sus siglas en inglés, fluorescein tear break-up time), hiperemias bulbar, limbar y tarsal, rugosidad tarsal, tinción corneal y conjuntival con fluoresceína, y test de Schirmer. Por último, a los no usuarios se les realizó una citología por impresión conjuntival y una microscopía confocal in vivo de la córnea. Los usuarios de LC acudieron a otras 4 visitas más: 2 visitas (mañana y tarde) en 2 días (no uso y uso de LC). La visita por la mañana del día de uso de LC se planteó para evaluar a los sujetos después de 30 a 60 minutos de uso de LC; mientras que la visita de la tarde del día de uso de LC se planteó para evaluar a los ULCS mientras tenían CLD. El tiempo de uso de LC durante el día de uso de LC fue pareado uno a uno entre los sujetos de ambos grupos. En estas visitas se les evaluó el confort ocular mediante una escala de valoración visual (EVV), se les recogió una muestra de lágrima y se les realizó una serie de pruebas clínicas: área del menisco lagrimal, tiempo de ruptura lagrimal no invasivo (NIBUT por sus siglas en inglés, non-invasive tear break-up time), e hiperemias bulbar y limbar. En las visitas de la tarde también se evaluaron los pliegues paralelos al párpado (LIPCOF por sus siglas en inglés, Lid Parallel Conjunctival Folds), tinción corneal y conjuntival con fluoresceína, epiteliopatía en parabrisas (LWE por sus siglas en inglés, Lid Wiper Epitheliopaty), y sensibilidad corneal y conjuntival. Además, en la visita de la tarde del día de uso de LC se les realizó una citología por impresión conjuntival; y en la visita de la tarde del día de no uso de LC se les realizó una microscopía confocal in vivo de la córnea. Posteriormente, se analizaron las imágenes de microscopía confocal de la córnea para obtener el número y densidad de nervios corneales, la densidad de ramificaciones nerviosas, el grado de tortuosidad nerviosa y la densidad de células dendríticas; las muestras de lágrima se analizaron para obtener los niveles en lágrima de EGF, eotaxina-1/CCL11, fractalquina/CX3CL1, IFN-γ, IL-1β, IL-1Ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8/CXCL8, IL-9, IL-10, IL-12 (p-70), IL-13, IL-17A, IP-10/CXCL10, MCP-1/CCL2, MIP-1α/CCL3, MMP-9, RANTES/CCL5, TNF-α y VEGF mediante tecnología XMAP en un Luminex IS-100, y los niveles de sustancia P mediante ELISA; y las muestras de células conjuntivales se analizaron mediante RT-PCR en tiempo real para obtener la expresión de 85 genes relacionados con dolor neuropático e inflamatorio. Proyecto UNSW En el proyecto llevado a cabo en la UNSW se analizaron de forma retrospectiva imágenes recogidas mediante microscopía confocal in vivo de la conjuntiva tarsal de 60 usuarios de LC hidrofílicas, 16 usuarios previos y 16 no usuarios. Además, los usuarios de LC habían completado el CLDEQ-8, mientras que los usuarios previos y no usuarios habían completado el Dry Eye Questionnaire (DEQ)-5. Las imágenes obtenidas por microscopía confocal de esta zona se han interpretado frecuentemente en la literatura científica como acinos de las glándulas de Meibomio; sin embargo, recientemente Zhou y Robertson identificaron estas estructuras como las crestas de rete de la unión dermo-epidérmica de la conjuntiva tarsal. Por tanto, estas imágenes se analizaron para obtener la densidad de papilas dérmicas, diámetro menor, diámetro mayor, área, circularidad, diferencia de luminosidad interior/pared, irregularidad, reflectividad, apariencia heterogénea de la pared y apariencia heterogénea de las crestas de rete. Estudios de investigación El proyecto IOBA dio lugar a cuatro estudios de investigación (los estudios 1, 2, 4 y 5); mientras que el proyecto UNSW dio lugar a un estudio de investigación (el estudio 3). Los detalles de estos estudios se explican a continuación. En el estudio 1 se incluyeron sujetos del proyecto IOBA: 41 usuarios de LC hidrofílicas, clasificados en ULCS o ULCA usando el CLDEQ-8, y 20 no usuarios. Se analizaron las pruebas clínicas realizadas en la visita inicial: osmolaridad lagrimal, hiperemia bulbar, hiperemia tarsal, rugosidad tarsal, FBUT, tinción corneal, tinción conjuntival y test de Schirmer. Los datos se compararon entre grupos usando el análisis de la varianza (ANOVA) y la t de Student o la H de Kruskal-Wallis y la U de Mann-Whitney, aplicando la corrección de Bonferroni. En el estudio 2 se incluyeron sujetos del proyecto IOBA: 40 usuarios de LC hidrofílicas y 20 no usuarios. Se usó el CLDEQ-versión corta para dividir a los usuarios en 20 ULCS y 20 ULCA. Se consideraron las siguientes propiedades de los materiales: el tipo de LC (16 de hidrogel convencional y 24 de hidrogel de silicona), el contenido en agua, la transmisibilidad al oxígeno y el módulo de elasticidad. Se analizaron las imágenes de microscopía confocal de la córnea: número y densidad de nervios corneales, la densidad de ramificaciones nerviosas, el grado de tortuosidad nerviosa y la densidad de células dendríticas. Los efectos de la CLD y las propiedades de los materiales se analizaron estadísticamente en los parámetros de la microscopía confocal. En el estudio 3 se incluyeron los sujetos del proyecto UNSW: 60 usuarios de LC hidrofílicas, 16 usuarios previos y 16 no usuarios. Además, los sujetos se clasificaron como sintomáticos o asintomáticos con el CLDEQ-8 y el DEQ-5. Se analizaron las imágenes obtenidas por microscopía confocal de la conjuntiva tarsal: densidad de papilas dérmicas, diámetro menor, diámetro mayor, área, circularidad, diferencia de luminosidad interior/pared, irregularidad, reflectividad, apariencia heterogénea de la pared y apariencia heterogénea de las crestas de rete. Los efectos del uso de LC, síntomas y su interacción se analizaron usando el ANOVA de dos vías. Las correlaciones se analizaron usando el coeficiente de correlación de Spearman. En el estudio 4 se incluyeron sujetos del proyecto IOBA: 60 usuarios de LC hidrofílicas, clasificados en 30 ULCS y 30 ULCA usando el CLDEQ-versión corta. Se analizaron las pruebas clínicas y el análisis de lágrima de las visitas de los días de uso y no uso de LC. Por tanto, en todas las visitas se evaluó la EVV de confort ocular, área del menisco lagrimal, NIBUT, hiperemia bulbar y limbar y se recogió una muestra de lágrima. En las visitas de tarde se evaluó LIPCOF, tinción corneal y conjuntival con fluoresceína, LWE y sensibilidad corneal y conjuntival. Se analizaron los niveles en lágrima de los 23 mediadores inflamatorios previamente mencionados y sustancia P. Los efectos del uso de LC, momento del día y grupo se analizaron estadísticamente en el confort, pruebas clínicas y moléculas en lágrima. En el estudio 5 se incluyeron sujetos del proyecto IOBA: 8 no usuarios y 16 usuarios de LC hidrofílicas, divididos en 8 ULCA y 8 ULCS con el CLDEQ-versión corta. Se analizó la expresión de 85 genes involucrados en dolor neuropático e inflamatorio en las muestras de células conjuntivales. Se analizaron estadísticamente los genes diferencialmente expresados entre los no usuarios y los usuarios de LC y entre los ULCA y los ULCS. Se llevó a cabo un análisis de enriquecimiento para asignar significado biológico a los grupos de genes diferencialmente expresados. RESULTADOS En el estudio 1 se obtuvieron los siguientes resultados. Se encontraron diferencias significativas entre los grupos para la osmolaridad lagrimal (p<0,001), la hiperemia limbar (p=0,014) y la hiperemia tarsal (p=0,031). Las comparaciones por pares revelaron que, con respecto a los no usuarios, los ULCS y ULCA tuvieron mayor osmolaridad lagrimal (p<0,003, ambas comparaciones) e hiperemia limbar (p=0,027 y p=0,048, respectivamente). Además, los ULCS tuvieron mayor hiperemia tarsal (p=0,03) que los no usuarios. No se encontraron correlaciones significativas (p>0,05) entre el CLDEQ-8 y los signos clínicos. En el estudio 2 se obtuvieron los siguientes resultados. No se encontraron diferencias significativas entre los ULCS, ULCA y no usuarios en ninguno de los parámetros (p>0.05). La densidad de células dendríticas fue mayor en los usuarios de LC de hidrogel convencional comparado con los usuarios de hidrogel de silicona y los no usuarios (p=0,002). La densidad de células dendríticas tendió a ser mayor según decrecía la transmisibilidad al oxígeno (p=0,07). En el estudio 3 se obtuvieron los siguientes resultados. Los usuarios de LC, comparado con los usuarios previos y los no usuarios, mostraron mayor circularidad (p=0,003) y menor irregularidad (p=0,023) de las papilas dérmicas. Así también los sujetos con síntomas, comparado con los asintomáticos, mostraron mayor circularidad (p<0,001) y menor irregularidad (p=0,009). En los usuarios previos, aquellos con síntomas mostraron mayor densidad (p=0,013) y circularidad (p=0,016). En los no usuarios, aquellos con síntomas mostraron mayor circularidad (p<0,001). El DEQ-5 se correlacionó con la circularidad (p=0,001). En el estudio 4 se obtuvieron los siguientes resultados. El confort, área del menisco lagrimal, NIBUT y MMP-9 fueron menores y tinción conjuntival y EGF mayores (p≤0,015) el día de uso de LC comparado con el día de no uso. El confort, IL-8/CXCL8 y VEGF fueron menores y EGF, IP-10/CXCL10 y MCP-1/CCL2 mayores (p≤0,047) en la tarde comparado con la mañana. El confort fue menor y la sustancia P mayor (p≤0,006) en los ULCS comparado con los ULCA. En el estudio 5 se obtuvieron los siguientes resultados. Los usuarios de LC, comparado con los no usuarios, presentaron 12 genes sobreexpresados (p<0,05), incluyendo, entre otros, genes asociados con analgesia (IL10, PDYN y PENK), y 28 genes infraexpresados, incluyendo genes relacionados con la modulación del dolor (CCL2, IL1A, IL1B, IL2 y NGF). Por el contrario, los ULCS, comparado con los ULCA, presentaron 11 genes sobreexpresados (p<0,05), incluyendo CCL2, IL1A, IL1B, IL2 y NGF, y 9 genes infraexpresados, incluyendo PDYN y PENK. Los términos sobrerrepresentados del análisis de enriquecimiento (p<0,05) estuvieron principalmente relacionados con dolor, transmisión nerviosa e inflamación. CONCLUSIONES Se alcanzaron las conclusiones que se exponen a continuación. La conclusión 1 es que el uso de LC hidrofílicas es capaz de reducir el volumen y la estabilidad lagrimal, y aumentar la osmolaridad lagrimal, la hiperemia limbar y la tinción con fluoresceína de la conjuntiva bulbar; sin embargo, solo un aumento de la hiperemia de la conjuntiva tarsal parece estar parcialmente asociado con la CLD. La conclusión 2 es que el uso de LC de hidrogel convencional, en comparación con LC de hidrogel de silicona, podría estar involucrado en el reclutamiento de células dendríticas al plexo nervioso sub-basal de la córnea; sin embargo, la CLD no parece estar asociada con alteraciones en la morfología de las fibras nerviosas o la densidad de células dendríticas del plexo nervioso sub-basal de la córnea. La conclusión 3 es que el uso de LC hidrofílicas modifica las papilas dérmicas de la conjuntiva tarsal a una forma más redondeada; además, una forma más redondeada de las papilas dérmicas está asociada con síntomas oculares en no usuarios, pero no en usuarios de LC. La conclusión 4 es que el uso de LC hidrofílicas altera los niveles de algunos mediadores inflamatorios en lágrima; sin embargo, la CLD no parece estar asociada con un cambio en los niveles en lágrima de estos mediadores; por el contrario, un incremento en los niveles en lágrima de sustancia P podría estar implicado en el desarrollo de la CLD. La conclusión 5 es que el uso de LC hidrofílicas parece producir un mecanismo de desensibilización mediado por la expresión génica de opioides endógenos, citoquinas inflamatorias y proteínas quinasas activadas por mitógenos, el cual podría ser responsable de un uso de LC cómodo; por el contrario, un desequilibro o mal funcionamiento de este mecanismo podría estar relacionado con los síntomas de CLD. En resumen, esta tesis ha demostrado que el uso de LC hidrofílicas es capaz de inducir un leve estado inflamatorio de la superficie ocular detectado tanto clínica como molecularmente. El uso de LC cómodo parece estar relacionado con un mecanismo de desensibilización de la superficie ocular, mientras que la presencia de CLD parece estar provocada por un mal funcionamiento de este mecanismo.