Bioinspired functional polymers for regenerative medicinecontribution of biomimetic approaches to tissue engineering challenges

Résumé

1. INTRODUCCIÓN La Ingeniería de Tejidos (IT) y la Medicina Regenerativa (MR) son áreas de gran interés y desarrollo en la medicina que han surgido para superar las limitaciones que presentan las metodologías actualmente utilizadas en la reparación de tejidos . Así, los campos de la IT y la MR están relacionados con la regeneración o reparación de tejidos u órganos dañados para restablecer su función biológica regular, centrándose en la estimulación de los mecanismos de reparación propios del cuerpo. La IT es un campo multidisciplinar que reúne conocimientos de los campos de la ciencia y tecnología de los materiales, la biología celular y la ingeniería biomédica para desarrollar dispositivos biomédicos que puedan implantarse en pacientes para inducir la regeneración de tejidos. Los dispositivos biomédicos generalmente combinan un andamio como material de soporte, células vivas y moléculas bioactivas. El andamio actúa esencialmente como plantilla o soporte para proporcionar un entorno celular apropiado que promueva la capacidad nativa de las células para adherirse, migrar, proliferar y diferenciarse dando lugar al crecimiento de nuevo tejido denominado tejido incipiente o equivalente tisular o constructo (del inglés construct). Hoy en día, el desarrollo de nuevas estrategias en IT y MR constituye uno de los principales retos científicos que se espera que tengan un impacto importante en el futuro en la práctica clínica, mejorando la calidad de vida del paciente. Un andamio ideal para ingeniería de tejidos debe reunir una buena biocompatibilidad, biodegradación, así como las propiedades mecánicas y la arquitectura estructural adecuadas a los requisitos específicos de cada aplicación médica individual. Por lo tanto, un punto clave en la ingeniería de tejidos, es la elección del biomaterial para fabricar el andamio más adecuado. Actualmente se están dedicando grandes esfuerzos para desarrollar nuevos biomateriales que imitan la matriz extracelular (MEC) con una amplia gama de propiedades y respuestas biológicas controladas y que puedan usarse para la regeneración de diferentes tejidos. Paralelamente a la necesidad de nuevos biomateriales está el desarrollo de técnicas para producir andamios con propiedades adecuadas. Numerosas tecnologías de fabricación están disponibles para transformar biomateriales sintéticos y naturales en andamios de una amplia gama de formas y tamaños. La técnica de fabricación y la morfología del andamio elegidas deben adaptarse a la aplicación concreta. Sin embargo, el logro de la fabricación de estructuras de tejidos/órganos humanos personalizada sigue siendo un problema complejo en la comunidad científica, y, en este sentido la selección de los biomateriales y la tecnología adecuados, así como vencer los obstáculos para la traslación clínica deben ser abordados en mayor profundidad. Las recientes investigaciones en los campos de la IT y la MR demuestran el creciente interés en el desarrollo de materiales biomiméticos y bioinspirados avanzados. La tecnología biomimética y bioinspirada considera a la naturaleza como una gran fuente de inspiración y utiliza características clave de materiales naturales y / o estructuras biológicas como base para el diseño de nuevos biomateriales. Concretamente, la forma natural de adhesión de los mejillones a las rocas ha sido una fuente de inspiración para desarrollar polímeros bioadhesivos que se adhieran a las interfaces biológicas, principalmente en condiciones húmedas. La capacidad de los mejillones de anclarse fuertemente a las rocas en condiciones marinas severas se atribuye a la secreción de un biso de proteínas adhesivas (Mfps) del pie del mejillón, cuyo principal componente es un aminoácido que contiene el grupo catecol llamado L-3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA). En los últimos años, el diseño de polímeros sintéticos funcionalizados con grupos catecol ha aumentado considerablemente en el campo de los biomateriales abarcando diferentes aplicaciones en IT. En este sentido, la versatilidad de la química del catecol permite la preparación y el desarrollo de numerosas plataformas bioactivas y bioadhesivas para una amplia gama de aplicaciones biomédicas con una perspectiva muy prometedora. Un objetivo específico importante en IT y MR es el desarrollo de apósitos o constructos eficientes para ayudar y mejorar el proceso de curación en heridas crónicas. La curación de heridas se refiere al proceso de reemplazo o restauración del tejido dañado por tejido nuevo para restablecer su función. Es un proceso gradual que comprende cuatro etapas integradas: (1) hemostasia e inflamación, caracterizadas por infiltración de macrófagos o leucocitos y secreción de citoquinas; (2) proliferación, que implica la eliminación del tejido dañado, el desarrollo del tejido de granulación, la angiogénesis y la reepitelización; (3) maduración, cuando la MEC producida se vuelve bien definida; y finalmente (4) la remodelación o la formación de tejido cicatricial y el logro del tejido funcional de la piel. Estas etapas complejas implican la interacción de diferentes tipos de células, moléculas bioactivas, y la MEC, que actúa como plataforma de soporte. Sin embargo, las heridas cutáneas traumáticas grandes debido a quemaduras o accidentes, así como aquellas derivadas de enfermedades como la diabetes pueden provocar el mal funcionamiento del proceso y la formación de heridas crónicas, que representan un importante problema de salud a nivel global. En las heridas crónicas, el proceso de cicatrización se obstruye generalmente en la fase inicial y difiere del patrón de cicatrización regular del tejido de la piel, por lo que es particularmente difícil de curar. Las estrategias de curación de heridas en IT se basan en proporcionar un andamio artificial que ejerce la función de actuar como una matriz provisional para que las células proliferen y generen nuevo tejido. El diseño de un andamio adecuado implica la selección del biomaterial, tipo de célula y estructura apropiados. Los andamios diseñados deben ser no inmunogénicos, biocompatibles, bioreabsorbibles y porosos. Además, la matriz debe mostrar una buena integración con la herida, una resistencia mecánica adecuada (similar a la piel) para proporcionar soporte físico, propiedades de barrera para proteger la herida y capacidad para promover la cicatrización del tejido. La terapia celular se ha convertido en una modalidad prometedora para mejorar el proceso de cicatrización de heridas. También, se han explorado enfoques basados en la funcionalización de andamios con moléculas bioactivas como factores de crecimiento o fármacos. De esta manera, los andamios pueden servir como un nicho para que las células proliferen, pero también para proporcionarles señales que puedan desencadenar el proceso de regeneración del tejido dañado. Otro punto crítico de la ingeniería del tejido epitelial radica en la ingeniería estructural de los andamios. En los últimos años, diferentes injertos de piel o apósitos para heridas disponibles comercialmente han demostrado resultados prometedores para el tratamiento de distintos tipos de heridas. Sin embargo, si bien se han reportado numerosos materiales y apósitos para heridas en las dos o tres últimas décadas, solo una minoría se ha sometido a ensayos clínicos. Por lo tanto, es necesario realizar más investigaciones y análisis clínicos para poder trasladar los nuevos sistemas desarrollados y tecnologías avanzadas implementadas a la clínica. La tendencia futura de las estrategias de IT en la curación de heridas abre la puerta a nuevas terapias que puedan acelerar el proceso de curación, disminuir el dolor y mejorar la calidad de vida del paciente. 2. OBJETIVOS El objetivo global de esta Tesis es explorar el desarrollo de nuevos polímeros bioinspirados para su aplicación como materiales avanzados en el campo de la medicina regenerativa, como la regeneración osteocondral o de tejido epitelial. La bioactividad y la versatilidad sobresaliente de los grupos catecol que presentan propiedades adhesivas, antioxidantes y antiinflamatorias, permiten la preparación y fabricación de diferentes materiales avanzados utilizando técnicas que den lugar a sistemas con estructuras desde 2D a andamios 3D, así como explorar terapias celulares. Esta Tesis cubre por tanto los aspectos de diseño molecular, preparación de materiales, fabricación de soportes, análisis de propiedades y estudio del comportamiento biológico de los sistemas desarrollados. Para lograr este objetivo global, a lo largo de los capítulos se recopilan 5 trabajos científicos de acuerdo con los objetivos específicos que se describen a continuación. -El primer objetivo específico de esta Tesis es la preparación y el estudio de polímeros inteligentes (aquellos que muestran cambios conformacionales en respuesta a estímulos ambientales) con propiedades bioadhesivas y termosensibles inspirados en el mecanismo de adhesión de los mejillones para su potencial aplicación como sistemas de liberación de fármacos o para regeneración osteocondral. Específicamente, en el Capítulo 2 el objetivo se centra en la síntesis de un monómero acrílico de cadena lateral larga portador de grupos catecol, la preparación de sus copolímeros con N-vinilcaprolactama y el estudio de la influencia de la composición de los copolímeros en las propiedades finales de los mismos. -El segundo objetivo específico pretende diseñar una familia de polímeros de alto peso molecular conjugados con grupos catecol y portadores de propiedades bioactivas así como la evaluación de sus propiedades para su potencial aplicación como apósitos en curación de heridas. En el Capítulo 3 se preparan dichos polímeros así como la formación de películas en 2D y se investiga la relación entre su estructura y propiedades finales, incluyendo su comportamiento biológico en cultivos celulares específicos. -El siguiente objetivo individual de esta Tesis consiste en abordar el desarrollo de andamios en base a redes interpenetradas para el tratamiento efectivo de heridas crónicas. El Capítulo 4 describe la preparación de un sistema híbrido que combina las propiedades beneficiosas de hidrogeles basados en quitosano (Ch) y ácido hialurónico oxidado (HAox) con polímeros sintéticos conjugados con grupos catecol y se investiga su aplicabilidad como áposito bioactivo para heridas. -El último objetivo específico se centra en la fabricación de andamios de hidrogel impresos en 3D para estrategias de ingeniería de tejidos de terapias celulares. De esta manera, en el Capítulo 5 se pone a punto una nueva estrategia de impresión 3D con el fin de mejorar las propiedades mecánicas de los hidrogeles. Esta nueva metodología se basa en el entrecruzamiento in situ de una biotinta basada en un hidrogel reactivo de dos componentes (Ch y HAox) en presencia de células vivas. Por otro lado, en el Capítulo 6, la nueva metodología se aplica para fabricar andamios impresos en 3D del hidrogel descrito cargado con nuevas nanopartículas funcionalizadas con catecol para su aplicación en el tratamiento del cuidado de heridas. En este sistema 3D se combinan las propiedades beneficiosas de los hidrogeles biomiméticos con las propiedades bioactivas de las nanopartículas. 3. METODOLOGÍA La metodología llevada a cabo para la síntesis de polímeros, fabricación de materiales, caracterización fisicoquímica, estudio in vitro y comportamiento biológico de los sistemas desarrollados se resume brevemente a continuación: La síntesis de polímeros funcionalizados con grupos catecol se ha llevado a cabo a través de dos estrategias: 1) funcionalización de un monómero acrílico de cadena lateral larga con grupos catecol y su posterior copolimerización radical con el monómero termosensible N-vinilcaprolactama; y 2) copolimerización de N-vinilcaprolactama y metacrilato de 2-hidroxietilo y la posterior conjugación de los copolímeros a través del cloruro de ácido hidrocafeico para obtener terpolímeros conjugados con gran disponibilidad de los grupos catecol. Seguidamente se han desarrollado materiales de diversas características utilizando los polímeros portadores de grupos catecol, polímeros naturales y sistemas híbridos que combinan ambos tipos de polímeros. La técnica de fabricación y la morfología del andamio elegida en base a estructuras 2D o 3D se adaptó a la aplicación de cada material. Así, se han desarrollado películas 2D de los polímeros conjugados con catecol mediante la técnica de “solvent-casting”. Por otra parte, se ha llevado a cabo la preparación de soportes a base de sistemas interpenetrados formados por una red covalente de polímeros naturales (Ch y HAox) y una red iónica del terpolímero portador del grupo catecol. Finalmente, se han fabricado andamios celulares por impresión 3D aplicando una nueva estrategia de bioimpresión optimizada previamente en esta Tesis. Estos andamios 3D consisten en un hidrogel de quitosano y ácido hialurónico cargado con nanopartículas funcionalizadas con catecol. Previamente a la preparación de la biotinta se procedió a la fabricación de las nanopartículas autoensambladas de dos polímeros anfifílicos que contienen catecol en diferentes composiciones. Posteriormente, se desarrollaron los andamios 3D cargados con dichas nanoparticulas y fibroblastos. En esta Tesis se ha aplicado un gran número de técnicas de caracterización para estudiar la composición fisicoquímica, la morfología, y las propiedades térmicas y reológicas de los sistemas desarrollados: RMN, FTIR, MS, UV, SEC, DSC, TGA e Instron principalmente. Además, debido al potencial de aplicación de estos sistemas en el ámbito biomédico, se ha estudiado su comportamiento in vitro en cuanto a hinchamiento, degradación y liberación de especies de catecol en condiciones fisiológicas así como su citotoxicidad, proliferación celular sobre los soportes desarrollados, y sus propiedades bioactivas en cultivos celulares in vitro usando fibroblastos humanos, macrófagos, células endoteliales o células madre, y siguiendo protocolos estandarizados. Finalmente, se ha evaluado la biocompatibilidad in vivo de determinados sistemas utilizando un modelo de rata. 4. RESULTADOS En el Capítulo 2, la síntesis de un monómero acrílico de catecol de cadena lateral larga y flexible (CEMA) se ha llevado a cabo para la preparación de copolímeros con N-vinilcaprolactama. La reacción de copolimerización radical está claramente controlada por la naturaleza del grupo catecol del monómero CEMA, proporcionando sistemas poliméricos de bajo peso molecular con muy bajo índice de polidispersidad y alta homogeneidad. Los materiales han sido obtenidos con éxito con contenidos de CEMA entre 0,9 y 13,5% en moles. Los resultados muestran que el gel de copolímero preparado con un contenido de catecol relativamente alto (13,5% en moles) y gelatina posee excelentes propiedades bioadhesivas a superficies óseas. Además, los copolímeros con un contenido de catecol relativamente bajo (0,9-3,6% en moles) proporcionan sistemas termosensibles y con excelentes propiedades antioxidantes y anti-inflamatorias que varían en función de la composición de catecol en el copolímero. -La síntesis de copolímeros estadísticos de N-vinilcaprolactama y metacrilato de 2-hidroxietilo, y la posterior reacción de conjugación con cloruro de ácido hidrocafeico, portador de grupos catecol, se han llevado a cabo con éxito como se describe en el Capítulo 3. Esta vía de conjugación permite obtener polímeros de alto peso molecular, con un rendimiento relativamente alto y con alta disponibilidad de los grupos catecol laterales. Películas 2D preparadas con los terpolímeros funcionalizados han demostrado buenas propiedades bioadhesivas a piel porcina en condiciones húmedas; prevención del daño cutáneo inducido por los rayos UV; propiedades antioxidantes que controlan las especies reactivas de oxígeno generadas por células madre; y atenuación de la respuesta inflamatoria en cultivos de macrófagos. Además, se ha comprobado que estas propiedades están directamente relacionadas con la composición de catecol en los terpolímeros. -En el Capítulo 4, se han desarrollado hidrogeles basados en redes de polímeros interpenetrados. Estos sistemas consisten en una red entrecruzada covalentemente obtenida por reacción de Ch y HAox en presencia de un terpolímero de catecol sintético, que posteriormente se coordinó con Fe3+ para dar una red entrecruzada iónicamente. Los estudios in vitro demuestran que estos hidrogeles funcionalizados con catecol proporcionan un entorno adecuado para soportar el crecimiento, la migración y la proliferación celular; protegen las células contra el daño por estrés oxidativo inducido por especies reactivas de oxígeno; y promueven la disminución de la citoquina proinflamatoria IL-1ß. Las membranas de hidrogel han demostrado también una alta fuerza de adhesión tisular en condiciones húmedas a piel porcina. Además, el diseño del sistema interpenetrado permite la liberación controlada y sostenida de especies de catecol in situ. Finalmente, los experimentos in vivo revelan su biocompatibilidad y estabilidad, y los estudios histológicos indican respuestas inflamatorias normales y una vascularización más rápida atribuida a la presencia de los grupos catecol. -El estudio presentado en el Capítulo 5 describe el desarrollo de una biotinta reactiva de hidrogel con una metodología de impresión por extrusión basada en un sistema de doble jeringa con una herramienta de mezcla estática. Este método ha sido desarrollado con éxito y presenta múltiples ventajas dentro de la bioimpresión por extrusión 3D que ayudan a contrarrestar las débiles propiedades mecánicas intrínsecas de los hidrogeles: 1) la gelificación durante el proceso de extrusión proporciona suficiente viscosidad para imprimir con alta fidelidad de forma al usar soluciones precursoras de baja viscosidad, lo que permite una alta viabilidad celular de las células impresas; 2) el entrecruzamiento durante la extrusión evita la necesidad de un tratamiento adicional para mantener la forma impresa; 3) la estabilidad del andamio, si se requiere para el cultivo a largo plazo, se puede aumentar en un simple paso de incubación. Además, esta técnica permite la impresión con células vivas, al contrario de los materiales preparados en los capítulos anteriores donde la siembra de las células tiene lugar después de la fabricación del soporte. Los andamios bioimpresos obtenidos mostraron buena biocompatibilidad de las células encapsuladas, hinchamiento moderado y estabilidad estructural durante 14 días de cultivo. -En el Capítulo 6, se han desarrollado soportes de hidrogel por impresión 3D que contienen nuevas nanopartículas funcionalizadas con catecol (NP) aplicando la nueva metodología de bioimpresión por extrusión descrita en el Capítulo 5. En este caso, se han obtenido con éxito soportes por impresión de 2 capas con buena resolución y fidelidad de forma y con las NP distribuidas de forma uniforme. Los estudios in vitro realizados han demostrado la capacidad de la biotinta para promover la proliferación celular, así como la capacidad de las NP para promover la cicatrización de heridas: regulación de la producción de especies reactivas de oxígeno, respuesta antiinflamatoria y aumento de la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular. 5. CONCLUSIONES En esta Tesis se han desarrollado y aplicado nuevos polímeros inspirados en mejillones para la preparación de materiales avanzados con propiedades bioactivas para aplicación en medicina regenerativa, como la regeneración de tejidos de la piel. -La síntesis de dos familias diferentes de polímeros de catecol de brazo largo se ha llevado a cabo con éxito siguiendo dos vías de reacción diferentes: 1) funcionalización de un monómero con grupos catecol y su posterior polimerización radical para obtener copolímeros estadísticos portadores de grupos catecol (copolímeros VCL_CEMA), y 2) funcionalización directa de un copolímero con moléculas de catecol para obtener terpolímeros conjugados con grupos catecol (polímeros conjugados con catecol). Por un lado, se obtuvieron copolímeros VCL_CEMA con contenidos de CEMA entre 0,9 y 13,5% en moles mediante copolimerización por radicales libres que estuvo claramente controlada por la naturaleza del monómero portador de catecol, CEMA, proporcionando sistemas poliméricos de bajo peso molecular con muy bajo índice de polidispersidad y alta homogeneidad. Por otro lado, los polímeros conjugados con catecol proporcionaron polímeros de alto peso molecular con mayor disponibilidad de los grupos laterales de catecol. -Los copolímeros VCL_CEMA se han utilizado para la fabricación de polímeros "inteligentes". El contenido de la unidad monómerica con grupos catecol ha demostrado influir directamente en las propiedades biodhesivas, termosensibles, antioxidantes y anti-inflamatorias de los copolímeros resultantes. Por lo tanto, la composición de copolímero puede ser utilizada como una herramienta para la preparación de sistemas biomédicos con propiedades modulables y un gran potencial para el desarrollo de sistemas de administración de fármacos y geles bioactivos que pueden aplicarse en procesos de regeneración de tejidos. -Se han fabricado películas 2D utilizando los terpolímeros conjugados con diferentes composiciones de catecol (2 y 22% en moles). Se ha demostrado que la presencia de catecol en los terpolímeros proporciona fuertes propiedades bioadhesivas, la prevención del daño cutáneo inducido por rayos UV, propiedades antioxidantes y atenuación del daño inflamatorio. Las propiedades bioactivas encontradas son características clave en el proceso de cicatrización de heridas y, por lo tanto, podemos decir que estos materiales bioinspirados pueden ser excelentes candidatos para la aplicación como apósitos bioadhesivos y bioactivos. -Se han fabricado con éxito andamios de hidrogel basados en redes poliméricas interpenetradas (IPN) que contienen quitosano, ácido hialurónico y un terpolímero conjugado con catecol. La red obtenida ha demostrado que proporciona una buena proliferación celular, eficacia protegiendo las células contra el daño por estrés oxidativo, supresión de la respuesta inflamatoria y una alta bioadhesión a la piel porcina. Además, el diseño IPN proporciona una liberación controlada y sostenida de especies de catecol. Los estudios histológicos tras experimentación in vivo revelan buena biocompatibilidad y una vascularización más rápida en comparación a los sistemas que no contienen catecol. Por lo tanto, el terpolímero funcionalizado con catecol dota al hidrogel de una bioactividad que, junto con la liberación controlada de catecol, hace que este sistema posea un gran potencial de aplicación como áposito en heridas crónicas y mejorar el proceso de regeneración de la lesión. -Se han fabricado de manera efectiva andamios de hidrogel impresos en 3D basados en carboximetilquitosano y ácido hialurónico oxidado utilizando una novedosa estrategia de impresión 3D que permite la impresión con células vivas. La optimización de una biotinta de hidrogel reactivo de forma que la cinética de entrecruzamiento coincida con el proceso de impresión, ha hecho que los andamios bioimpresos resultantes presenten una buena fidelidad de forma, estabilidad estructural, y buena biocompatibilidad durante 14 días de cultivo. Dado que las concentraciones de los precursores y las condiciones de impresión pueden ser variadas fácilmente, esta metodología de impresión ofrece una gran versatilidad y se prevé que pueda adaptarse a una amplia gama de sistemas reactivos, previo ajuste de su cinética de reticulación, para ser utilizada en el futuro para diversas aplicaciones en medicina regenerativa e ingeniería de tejidos. -La técnica de nanoprecipitación ha permitido fabricar nanopartículas (NP) autoensambladas de los terpolímeros conjugados de catecol con dos composiciones de catecol (2 y 29% en moles). Las nanopartículas resultantes presentaron morfología esférica y tamaños de partícula con baja polidispersidad. Además, demostraron alta estabilidad y capacidad para servir como nano-vehículos para transportar fármacos hidrófobos como la cumarina-6. Los estudios celulares in vitro demostraron que estas NP funcionalizadas con catecol protegen a las células contra el daño por estrés oxidativo inducido por las especies radicales de oxígeno, regulan la respuesta inflamatoria y promueven la regulación positiva del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Por lo tanto, las NP desarrolladas presentan propiedades para promover la cicatrización de heridas y potencial para aplicación en la IT y liberación controlada de fármacos. -Aprovechando la estrategia de bioimpresión 3D desarrollada anteriormente, se han fabricado andamios 3D de hidrogel impresos que contienen las nanopartículas funcionalizadas con catecol. Los andamios cuadrados de 2 capas presentaron NP uniformemente distribuidas, una buena resolución y fidelidad de forma. Un ajuste adicional del cabezal de impresión de mezcla permitiría construir estructuras más grandes en estudios posteriores. Estos sistemas resultaron adecuados para soportar el crecimiento y proliferación de fibroblastos y presentaron propiedades bioactivas provenientes de las nanopartículas. La biotinta cargada con NP desarrollada en este trabajo tiene una aplicación prometedora en terapias de curación de heridas con varias ventajas: 1) la liberación controlada de las NP en el sitio de la herida proporciona una función bioactiva localizada; 2) las NP funcionalizadas pueden actuar como nano-vehículos para múltiples fármacos hidrófobos; 3) el enfoque de impresión utilizado permite adaptar la geometría, los materiales y las dosis de formulación según los requisitos del paciente para tratamientos específicos de heridas.