Accessing new biomedical applications by combining genetic design and chemical modification of elastin-like recombinamers

Résumé

Introducción La adquisición de un conocimiento profundo de biomateriales requiere comprender su papel en diversas aplicaciones, tanto en ingeniería de tejidos como en nanotecnología. Dentro de las distintas estrategias destinadas al desarrollo de aplicaciones biomédicas, cabe destacar el uso de materiales que mimetizan las propiedades y características propias que se encuentran en materiales naturales1. En primer lugar, los materiales empleados para aplicaciones médicas deben de cumplir una serie de requisitos como la biocompatibilidad, pero además deben aportar funciones específicas para su uso, como estabilidad mecánica, o la posibilidad de ajustar la degradación del propio material. Los primeros materiales empleados en biomedicina fueron distintos metales o cerámicas, ya conocido por las antiguas civilizaciones2. Tras esto, con el avance de la química macromolecular aparecieron los polímeros sintéticos como el ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) o el ácido poliláctico (PLLA). En las últimas décadas el desarrollo de la ingeniería genética y de la tecnología del ADN recombinante ha permitido generar nuevos materiales proteicos, los cuales representan un gran paso en la fabricación de materiales biomiméticos3,4. De este modo, se abría un extenso abanico de posibilidades para el uso del biomaterial más abundante, y probablemente más complejo que podemos encontrar en la naturaleza, las proteínas. En los últimos años, la ciencia ha hecho un gran avance en la elucidación estructural de proteínas, y sigue avanzando en el estudio de las relaciones entre estructura y función3,4. Este conocimiento permite no sólo modificar la secuencia de un material tan complejo como las proteínas, e incluso mejorarlas. Dentro de esta clase de biomateriales recombinantes, encontramos la familia de proteínas inspirada en la secuencia de aminoácidos de la tropoelastina natural, que es el monómero soluble de la elastina5–11. De forma simplificada nos referimos a esta familia de proteínas es como recombinámeros tipo elastina (“elastin-like recombinamers”, ELRs, en inglés). Las ventajas en el uso de la tropoelastina como “proteína madre”, son las funcionalidades ésta como biocompatibilidad, elasticidad y comportamiento termo-sensible que conduce a procesos de auto-ensamblado12. Además, la secuencia subyacente de amino ácidos a estas propiedades es bastante simple desde el punto de vista de la complejidad de las proteínas. Dicha secuencia está basada en la repetición del pentapéptido L-Valina-L-Prolina-Glicina-X-Glicina (VPGXG), en el que X (denominado aminoácido invitado) puede ser cualquier aminoácido, excepto L-Prolina7,13–17. Dependiendo del número de repeticiones y de la composición del amino acido invitado, X, se pueden crear una gran variedad de ELRs. Debido a su carácter recombinante, es posible fusionar secuencias de ADN que codifican distintos péptidos y proteínas. Así se puede combinar bloques de pentapéptidos con distintos aminoácidos invitados, en el lugar X, en la misma molécula del ELR. Además, es posible añadir secuencias peptídicas como secuencias biodegradables18,19, o con dominio de adhesión celular20,21 para generar materiales ‘a la carta’ de la aplicación deseada. Objetivos El objetivo de esta tesis es demostrar que la versatilidad de estos recombinámeros se puede aumentar meidante modificación química y genética para la configurar la degradación, el autoensamblado y la interacción con células de los ELRs. El trabajo desarrollado en esta tesis aborda todo el proceso de diseño, producción, purificación, caracterización y aplicación directa de los nuevos ELRs. Para ello, se han utilizado una amplia variedad técnicas de ingeniería genética, microbiología, física, química junto con los correspondientes cultivos celulares. A. La tecnología del ADN recombinante permite un control total sobre el diseño de ELR, y de este modo la inserción de distintas secuencias biofuncionales, como secuencias sensibles a proteasas. Mediante el control de la disposición espacial de este tipo de secuencias proteolíticas queremos demostrar la biodegradación especifica de ELRs. Además, la capacidad de biodegradación selectiva será aplicada para la biofabricación de sustratos para detección zimográfica. B. Debido a la degradabbilidad controlable de los ELRs, su uso será estudiado como sustrato selectivo para la identificación de enzimas proteolíticas. Por lo tanto, siguiendo el estudio de la aplicación de ELRs para técnicas zimográficas diseñaremos un nuevo método de detección de proteasas con potencial para sistemas de inspección avanzados de alto rendimiento. C. Se ha demostrado que los biomateriales modificados con colesterol exhiben fuertes interacciones intermoleculares. Así, aplicaremos estas interacciones en un sistema de ELRs para generar fuerzas intermoleculares que desencadenen el autoensamblado de los ELR. D. Además, gracias a la capacidad de interacción de los grupos colesterol con membranas lipídicas, estudiaremos la capacidad de ELRs ricos en colesterol para mejorar la interacción de los éstos con ciertos tipos celulares implicados en la captación de lípidos, para aumentar el recubrimiento de células vivas con proteínas ELR. Metodología del Diseño de ELRs con grupos proteolíticos (A y B) Con el objetivo de utilizar ELRs como sustrato de zimografía de geles (IGZ) más específicas, se pueden fusionar secuencias de degradación enzimática, por ejemplo la secuencia que contiene el hexapéptido L-Valina-Glicina-L-Valina-L-Alanina-L-Prolina-Glicina (VGVAPG), y cuya L-Alanina con especificad a la enzima elastasa, aumentando la biodegradabilidad de los ELRs, que es de gran importancia en el remodelado del tejido22. Además concentraciones altas en proteasas también son típicamente efectos secundarios de cáncer promovando la infiltración de tejido23. Pese a que la degradación enzimática es más estudiada en el campo de la regeneración tisular, la degradación de sustratos basados en proteínas también puede ser utilizada para desarrollar técnicas de detección de proteasas, enzimas capaces de degradar proteínas. Una de las técnicas más conocido es la zimografía de gelatina24. El método funciona como una electroforesis de poliacrilamida en que la gelatina se añade al gel, si la muestra electroforética en ese gel contiene una enzima con actividad proteolítica, la gelatina será degradada en el lugar que corresponde al peso molecular de esta proteasa. En el caso de la gelatina este método está bien establecida por los metalloproteasas de la matriz MMP2 y MMP925. Sin embargo, aparte de gelatina, otras proteínas naturales pueden utilizarse como substrato de la zimografía, y de este modo aumentar la variedad de secuencias degradables presentadas a las enzimas. Por otro, lado esa variedad en su secuencia depende de muchos factores, como el organismo de origen o el proceso de purificación. Así, aunque de la gelatina se conocen muchos elementos estructurales, se desconoce su secuencia completa. Por lo que, los resultados pueden ser confusos, e inclusos erróneos debido a que no se conozca la secuencia proteolítica que está siendo degradada por la enzima. En esta tesis utilizamos ELRs como substrato para zimografia que presenten únicamente un grupo proteolítico, y que tengan una secuencia conocida, para investigar la degradación con una selección de MMPs 1 a 20. Esto facilita el uso de dicho ELRs en un nuevo método de zimografia dentro de una placa (in-well zymography (IWZ). Resultados (A y B) Los resultados mostraron que las diferencias en las concentraciones de peptidasas se pueden medir con zimografía utilizando ELRs como sustrato. Además, el uso de ELRs permitió la detección de proteasas de degradación inespecífica tipo serina, las cuales son indetectables en sustratos clásicos como la gelatina. Más concretamente, los resultados revelaron que, a diferencia de métodos zimográficos clásicos, la ELR-IGZ permite la detección de las enzimas metaloproteasas MMP2 y MMP9. La sensibilidad hacia MMP9 fue casi diez veces mayor con ELREla + FN que en gelatina, mientras que el control negativo ELR sin ninguna región proteolítica no fue degradado. El cambio a IWZ reduce la complejidad en comparación con IGZ mediante la eliminación de la separación electroforética y la desnaturalización de la muestra. La sensibilidad se limitó a un 10% respecto al control no degradado. Se pudo detectar patrones distintos de degradación de cada MMP y se redujo la cantidad necesaria para la cuantificación de 50-500 ng (en IGZ) a 10 ng por muestra. Los resultados permitieron clasificar las enzimas proteasas en cuatro grupos diferentes respecto a los sustratos empleados: 1) sin degradación (MMP 2, 3, 10, 14, 16, 19 y 20); 2) mediada por FN (MMP1, 13, 16); 3) mediada por ELA (MMP7); 4) no específica (MMP 8,9, 12, 17). Conclusiones (A y B) Se demostró que la producción de sustratos para IGZ basados en ELRs y secuencias proteolíticas. Los cuales permiten la incrustación en matrices de gel, y la detección con CBB. Empleando dos grupos de degradación diferente, se revelaron diferencias en la especifidad frente proteasas tipo serina y distintas MMPs. Cabe mencionar que el sustrato ELR-Control, al carecer de secuencias específicas de degradación, no fue digerido por ninguna de las MMPs seleccionadas, pero sí se detectó su ligera degradación en presencia de tripsina. La degradación del control pudo deberse a la presencia de lisinas que son son un punto de corte preferente para las proteasas tipo serina, además las lisinas, debido a su cadena lateral catiónica, son sensibles a la tinción con CBB. Por otro lado, presentamos un nuevo método de detección de proteasas mediante la adaptación de la IGZ en una zimografía de placa de pocillo (IWZ), lo que permite una lectura rápida y cuantitativa. Este nuevo método proporciona una técnica de detección capaz de determinar diferencias en patrones de degradación de metaloproteasas (MMP1-20) con sólo dos secuencias de degradación. El control positivo y negativo sirvió como un circuito de retroalimentación adicional en términos del patrón derivado. Complementariamente, este método de cuantificación permitiría seguir la cinética de degradación de cada una de las enzimas sobre los sustratos específicos. La especificidad de los sustratos basados en ELRs aporta varios avances a las técnicas zimográficas basadas en gel, por ejemplo gracias al control de los motivos de degradación se pueden elaborar dispositivos de reconocimiento de enzimas proteolíticas basado en un sistema binario. Metodología de la Modificación de ELRs con grupos hidrofóbicos (C) El interés por los biomateriales autoensamblados ha aumentado considerablemente en las últimas décadas debido a su compleja disposición espacial y a que puedan controlar la exposición de distintas funcionalidades. Las implicaciones directas de la estructura en el autoensamblaje en polímeros de bloque anfifílicos y proteínas, junto a la posibilidad de generar interacciones hidrofóbicas26,27 e hidrofílicas28,29, ha permitido cierto grado de control sobre estructuras jerárquicas, como micelas esféricas o cilíndricas, vesículas, membranas bimoleculares e hidrogeles30–33. Además, propiedades tales como la respuesta frente a estímulos como cambios de temperatura27,34 o pH35, han dado como resultado la aplicabilidad de estos materiales en la ingeniería de tejidos36, sistemas para la administración de fármacos35–38, dispersantes de polímeros39, agentes gelificantes físicos40 o biosensores41–43. La capacidad de respuesta térmica es la característica más investigada y mejor controlada para los copolímeros de bloque27,34 y, como tal, ha ganado un mayor interés en el diseño de proteínas recombinantes de vanguardia, especialmente a la luz de los hallazgos de Urry con respecto a la LCST de péptidos miméticos de elastina44–47. Además, debido a que los ELRs permiten distintos diseños modulares combinando bloque análogos con dominios de diferente hidrofilicidad, se han estudiado como modelos para comprender el plegamiento, el autoensamblaje y la función de otras proteínas naturales más complejas48–50. Aunque se espera que el comportamiento de separación de fases del tipo de temperatura de solución crítica superior (UCST) en el agua51–54 contribuya a la creación de materiales poliméricos intrínsecamente ordenados55–59, también se han observado ejemplos de proteínas intrínsecamente desordenados que exhiben separación de fases de tipo UCST55–59. Como la abductina y la resilina, que exhiben una UCST y LCST60,61, sin embargo, hasta la fecha no se ha observado una UCST tras la modificación química de las proteínas recombinantes, especialmente las ELRs. En este sentido, hemos aumentado la interacción hidrófoba de las proteínas mediante la adición de cadenas laterales de colesterol, que se sabe que fomenta las interacciones intermoleculares en los polímeros, aumentando el orden en la proteína y hemos investigado cómo se ve afectada la estructura secundaria de la proteína. Para una mejor comprensión de los determinantes de la gelificación inducida hidrofóbicamente, los ELR resultantes de la modificación con grupos colesterol (CTA) se caracterizaron en detalle; concentración crítica de micelas, ángulo de contacto, dispersión dinámica de la luz, dicroísmo circular, imágenes SEM y TEM. Se descubrió que los CTA resultantes (CTAx (x = número de grupos de colesterol)) constituyen un grupo de materiales novedoso y peculiar, los cuales presentan dos Tts y gelificación fría a temperaturas inferiores a UCST. Resultados (C) Debido a la naturaleza intrínsicamente desordenada de los ELRs, la formación de estructuras cristalinas para su análisis mediante espectroscopía de rayos X no es posible. Además su alto peso molecular dificulta enormemente su evaluación mediante espectroscopía de RMN, de este modo, se estudió mediante CD la estructura secundaria de los distintos ELRs modificados con grupos colesterol. La similitudes estructurales observadas entre los estados del CTA5 por encima de la LCST y por debajo de la UCST confirmaron la hipótesis de que el colesterol contribuye al autoensamblado de los ELRs por debajo de la temperatura de transición. De este modo, demostramos por primera vez que el comportamiento UCST puede ser inducido por modificaciones de la cadena lateral en ELRs. Para la caracterización de la gelificación fría (característica del los ELRCTAx), se investigaron soluciones de mayor concentración utilizando técnicas de reología oscilatoria y de flujo. En general, no se observó gelificación en ausencia de grupos laterales colerterol. Comparando el módulo de almacenamiento, se observó que éste aumentó en función del número de grupos colesterol (31 Pa para ELRCTA1 y 60 Pa ELRCTA5). De los resultados obtenidos se puede derivar el comportamiento de fase de ELRCTA5 con dos transiciones alrededor de 10 y 20 °C con una región intermedia de solubilidad, caracterizada por la ausencia de estructuras secundarias paralela y antiparalela (relajada). Metodologia Interacción celular de colesteryl ELRs (D) La bicapa de membrana es una barrera física que define la frontera de las células y divide el interior en distintos compartimentos con funciones especializadas. La naturaleza anfifílica de la membrana conduce a una superficie externa cargada negativamente y a un núcleo hidrófobo dentro de la membrana, que sirve como anclaje para proteínas de membrana y transmembrana62. En consecuencia, las células tienen la capacidad de unirse a sustratos mediante la unión de integrinas, interacciones electrostáticas, enlaces de hidrógeno o interacciones hidrofóbicas63. Además, la membrana contiene una variedad de compuestos y proteínas que son cruciales para la función celular. Una de las moléculas más abundantes en la membrana es el colesterol, que se encuentra dentro de la membrana debido a su hidrofobicidad. El colesterol representa hasta el 20% de la masa de la membrana63 y es responsable de la integridad de membrana además de participar en procesos de señalización celular. El colesterol, entre los muchos componentes lípidos de las membranas celulares de los mamíferos, es un regulador clave de la fluidez de la membrana y contribuye a la formación de caveolas y al mantenimiento del microdominio de las caveolas64,65. Las caveolas son dominios especializados de la membrana plasmática que se encuentran en la mayoría de los tipos de células66. Sin embargo, son más abundantes en células como adipocitos, células endoteliales, fibroblastos y células musculares67. Además de la influencia de la fluidez de la membrana, el colesterol es importante para la estructura y la función celular, es esencial en la locomoción y sirve como precursor metabólico para varias moléculas de señalización, incluidos los oxiesteroles68, los esteroides68 y los ácidos biliares65,69,70. La mayoría de los sustratos o hidrogeles se centran en motivos de unión a integrinas, en particular el motivo de RGD, para generar unión celular o la infiltración. Sin embargo, los materiales sintéticos con residuos de RGD unidos covalentemente luchan por cumplir con los resultados de los materiales de proteínas ECM nativas71. Otra investigación para la fabricación de construcciones de tejido 3D se ha centrado en la ingeniería de la lámina celular62, los liposomas magnéticos72, las perlas celulares73 y las células que contienen capas de gel74–76. En particular, la creación de nanodominios y microdominios específicos para distintos tipos celulares o específicos de tejido utilizando interacciones biológicas, como avidina-biotina77–80, anticuerpo-antígeno81,82, lectina-polisacáridos83,84 o proteínas ECM como fibronectina, colágeno y / o gelatina74,75,85–89, ha sido prometedora y permite la "manipulación jerárquica de células" in vitro85,88,90,91. Seleccionamos grupos colesterol como anclajes hidrófobicos debido que simulan la situación intramembranosa y facilitan la movilidad y distribución de las proteínas en la membrana. Para una mejor interacción del material de colesterol con la membrana, se estudió en tipos celulares ricos en caveolina como son las células derivadas del endotelio de la vena umbilical humana (HUVEC) y las células del músculo liso aórtico humano (HASMC), que están involucradas en la absorción de lípidos del fluido sanguíneo y en procesos tales como estenosis. Para ello, se modificaron varios ELRs con grupos colesterol y se estudió el potencial de estos grupos hidrófobos como anclajes intramembranosos para recubrimientos celulares. En este sentido, hemos desarrollado un recubrimiento celular basado en interacciones hidrófobas con la membrana celular. Para eludir las variaciones de proteínas naturales como variaciones específicas al organismos de origen, se utiliza un recombinante similar a la elastina análogo de ECM como proteína modelo para el recubrimiento inductivo de tejido. El objetivo principal es la creación de un recubrimiento proteico para células basado en una monocapa bien distribuida. Resultados (D) Los diferentes sustratos se probaron para determinar su efecto sobre la proliferación celular durante 7 días usando el ensayo AlamarBlue® a concentraciones de 375 y 750 nM. Los HUVEC no mostraron diferencias significativas en la proliferación en todas las condiciones, mientras que para los HASMC, el tratamiento con una alta concentración de los ELRs ELRCTA0 y ELRCTA1 condujo a la disminución de la proliferación con el tiempo. Se observó que el número de eventos de células fluorescentes aumentó de ELRCTA0 a ELRCTA5, del 10% al 80% (HUVEC), o del 20% al 85% (HASMC), respectivamente. Las células HASMC interactúaron en mayor medida con ELRCTA0 a ELRCTA3 , aumentando de un 20% a 60% respectivamente, mientras que la eficiencia de recubrimiento de estos ELRs permaneció por debajo del 30% para las células HUVEC. Además, las imágenes confocales de células tripsinizadas después de la incubación revelaron un cambio en la distribución de los ELRs en la membrana celular en función del contenido en colesterol, variando desde partículas de tamaño micrométrico aglomeradas (sin colesterol) hasta puntos submicrométricos altamente dispersados (con colesterol). Conclusiones (C y D) Hemos demostrado que las propiedades novedosas, como el autoensamblaje y la gelación termorreversible, se pueden controlar mediante la modificación selectiva de IDPs poliméricas, lo que resulta en materiales altamente innovadores que pueden exhibir un comportamiento UCST y LCST, donde el plegamiento y la formación de estructuras secundarias ordenadas se ve favorecida tanto por encima de la LCST como por debajo de la UCST. En base a nuestros resultados, los grupos de colesterol parecen actuar como mediadores estructurales, en este caso como estabilizadores de micelas en condiciones impulsadas por la entropía por encima de la LCST o como conectores de micelas expuestas en condiciones impulsadas por la entalpía por debajo de la UCST. En ambos casos, los grupos de colesterol aceleran la organización estructural de los ELR con el tiempo. El hecho de que se obtengan estructuras secundarias similares con grupos de colesterol orientados hacia adentro o hacia afuera (por debajo o por encima de la UCST y LCST, respectivamente) podría deberse al esqueleto del ELR subyacente, que gobierna los motivos estructurales a los que se puede acceder. Hasta donde sabemos, los restos hidrofóbicos que funcionan como anclajes de membrana celular para proteínas aún no se han investigado. Dado que no se observó ningún efecto citotóxico en los tipos celulares seleccionados a concentraciones bajas, con un resultado > 60% de células marcadas, el presente sistema puede conducir a una mejor comprensión de las interacciones hidrofóbicas membrana-sustrato y al desarrollo de nuevos recubrimientos celulares impulsados por la hidrofobicidad, proporcionando una alternativa a los recubrimientos actuales. Además, estos nuevos materiales y su versatilidad en términos de secuencia tienen un alto potencial como marcadores celulares, portadores de fármacos o dominios de unión celular hidrófobos.