Estandarización y optimización del proceso biotecnológico de obtención de polímeros proteicos con aplicaciones médicas

Resumen

RESUMEN DE TESIS: ESTANDARIZACIÓN Y OPTIMIZACIÓN DE LA BIOPRODUCCIÓN DE POLÍMEROS PROTEICOS CON APLICACIONES MÉDICAS El desarrollo de biomateriales de nueva generación empleados en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa, requiere de materiales con mayor complejidad y nuevas funcionalidades a la de los utilizados tradicionalmente. Dichas funcionalidades deben simular las de los tejidos vivos, para así poder ser substituidos temporal o definitivamente. Los materiales poliméricos elaborados a partir de componentes biológicos, como los aminoácidos, ofrecen la posibilidad de cubrir una gran variedad de propiedades y presentan la posibilidad de diseñarse y construirse con las secuencias necesarias para conseguir las propiedades mecánicas y funcionalidades requeridas para las aplicaciones a las que van dirigidos. Entre los materiales poliméricos proteicos conocidos, los polipéptidos tipo elastina (ELP¿s acrónimo del inglés Elastin Like Polymers) están siendo estudiados de forma profunda desde finales de los años 80, definiendo sus propiedades elastoméricas e inteligentes y su excelente biocompatibilidad. Estas propiedades los destacan como una clase de compuestos que pueden ser empleados en un gran número de aplicaciones, como alternativa a materiales menos sofisticados o en aplicaciones específicas para su estructura y propiedades. La biología facilita los más sofisticados conocimientos y medios para sintetizar tales compuestos. La ingeniería genética, o más propiamente las tecnologías del DNA recombinante, nos prestan sus potentes instrumentos para crear nuevos genes a fin de ¿confeccionar¿ polímeros funcionalizados ¿a la carta¿, mientras que la biotecnología permite bio-producirlos en organismos genéticamente modificados de forma eficiente, limpia, sostenible y económica. Desde este punto de vista, en el presente trabajo se han aplicado técnicas de diseño de experimentos, tales como diseño factorial, diseño de Plackett-Burman y diseño compuesto central, para conseguir que la producción de un biopolímero con secuencia de adhesión celular, diseñado por el grupo de investigación BIOFORGE, que hemos denominado HRGD6 sea óptima. Al ser muchos los factores que influyen en el crecimiento de los microorganismos, para poder analizar adecuadamente la influencia de ellos en la bioproducción, se han estudiado, por una parte, los factores que influyen en el crecimiento bacteriano, tales como temperatura, pH, y por otra parte, la composición del medio de cultivo, de cuya optimización se ha obtenido la concentración más adecuada de sustratos y nutrientes para obtener la máxima bioproducción. Por otro lado, el estudio de cada una de las etapas previas al cultivo propiamente dicho, nos ha proporcionado información sobre el efecto que producen en el rendimiento y en la variabilidad de la producción diferentes factores relacionados con la preparación de las placas, así como el tiempo de vida de las colonias, ya que la actividad bacteriana disminuye con el mismo. De esta forma, se han establecido las condiciones estándar de trabajo para dichas etapas. Para poder cuantificar los resultados obtenidos de los distintos experimentos diseñados, hemos puesto a punto el método de cuantificación. Debido a que el método de identificación de proteínas más apropiado durante el proceso es la electroforesis en gel de poliacrilamida, se han utilizado las bandas obtenidas mediante esta técnica para cuantificar la producción de HRGD6. Para ello, hemos seleccionado el método de tinción más adecuado y se ha puesto a punto un método de cuantificación de dichas bandas. Una de las propiedades más característica de estos biomateriales es la denominada Transición Térmica Inversa, definida por la temperatura de transición, específica para cada ELP. Dicha transición es reversible y ocurre al pasar de un estado de desorden conformacional, característico de las cadenas relativamente extendidas de estos polímeros por debajo de su Tt en disolución acuosa, a un estado no soluble al sobrepasar esta temperatura, donde las cadenas adoptan una disposición ordenada. Para el biopolímero denominado HRGD6 se ha llevado a cabo el estudio de la temperatura de transición inversa mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC) a distintos valores de pH, lo que nos ha permitido realizar los ciclos calentamiento-enfriamiento necesarios para la purificación del polímero al pH adecuado.