Dinamica de la ca2+ en el reticulo endoplasmico de celulas intactas

Résumé

El objetivo de esta tesis ha consistido en el estudio de la dinámica del calcio en el retículo endoplásmico de distintas células en respuesta a diversos estímulos. Para llevar a cabo las determinaciones experimentales utilizamos una técnica nueva basada en una fotoproteína, denominada aequorina, que emite luminiscencia cuando se une a este ión de foma proporcional a su concentración, dirigida específicamente al interior del retículo endoplásmico mediante ingeniería genética y mutada para reducir su afinidad por calcio al rango de medida adecuado. Comenzamos nuestro estudio en la línea celular tumoral HeLa, poniendo a punto la técnica de medida y determinando tanto el nivel estable como la dinámica de la (Ca2+) en el retículo. Además evidenciamos el funcionamiento y los mecanismos de regulación por calcio citosólico, luminal y procesos redox del receptor del IP3. Posteriormente ampliamos el estudio de la homeostasis del calcio en retículo endoplásmico a otros tipos celulares expresendo la aequorina mutada en el retículo mediante vectores virales. Una vez comprobada la eficacia funcional de la técnica de infección viral, centramos nuestro estudio enun tipo celular de gran relevancia fisiológica, por ser de estirpe neuroendocrina, la célula cromafín. Demostramos la regulación por calcio citosólico y luminal del receptor de ryanodina, así como la funcionalidad del mecanismo de liberación de calcio denominado CICR en estas células y el fenómeno de liberación cuantal inducido por cafeína.