Análisis de la expresión génica diferencial en un modelo experimental de endometriosis

Résumé

Introducción: La endometriosis se define como la presencia de tejido endometrial fuera de la cavidad uterina. La teoría de Sampson explica como las células endometriales pasan a través de las rompas de Falopio mediante menstruación retrógrada, se adhieren y crecen en la superficie peritoneal, lo cual lleva al desarrollo de lesiones endometriósicas en la pelvis. Algunos autores han utilizado la técnica de microarrays para estudiar la diferencia en la expresión génica entre endometrio ectópico y eutópico, pero todavía no se ha publicado la diferencia de la expresión génica entre las células del estroma y del epitelio de un mismo donante, con o sin contacto con el tejido peritoneal. En esta tesis doctoral, se ha creado un original modelo in vitro de co-cultivo, lo que permite analizar la expresión diferencial de genes que se produce en una situación de endometriosis, a través de análisis de microarrays de endometrio estromal y epitelial del tejido endometrial con y sin contacto con el tejido peritoneal. Material y métodos: Se realizaron tres series de experimentos por triplicado, implicando cultivo y co-cultivo a través de insertos y durante 12 horas, tanto en biopsias humanas del estroma como del epitelio endometrial (de mujeres en edad reproductiva donantes de ovocitos), junto con una línea celular comercial de células mesoteliales peritoneales (LP9). Se unificaron todas las muestras pertenecientes a un mismo grupo, y se obtuvieron siete pooles diferentes, uno por cada condición de cultivo, para su posterior análisis con microarrays. El perfil de expresión se determinó mediante comparación de los grupos experimentales, en contacto con el peritoneo, con los controles (2 a 2). Para validar la expresión diferencial de genes en los microarrays, se analizaron los niveles de ARNm del gen trombospondina 1 (THBS1), catenina 1 (CTNB1), E-cadherina (CDH1), N-cadherina (CDH2), mesotelina (MSLN) y mucina (MUC16), mediante PCR cuantitativa a tiempo real. El análisis estadístico se realizó con el uso del paquete estadístico IBM SPSS Statistics 18 software. El test no paramétrico U Mann-Whitney se utiliza para comparar los promedios de expresión génica obtenidos entre las muestras con y sin contacto con el tejido peritoneal. Se consideró estadísticamente significativo un p-valor <0,05. Resultados: En relación con la adhesión, 154 genes tuvieron una tasa de cambio absoluta mayor o igual a 2,0 en el epitelio endometrial en contacto con el peritoneo vs. el epitelio control. Se encontraron 208 genes desregulados al menos dos veces en el estroma endometrial en contacto con el peritoneo vs. el estroma control y 28 genes desregulados al menos dos veces en el LP9 en contacto con las células del epitelio vs. LP9 control. La expersión de los genes seleccionados fue confirmada por PCR cuantitativa a tiempo real y los resultados indican cambios consistentes en el perfil de expresión génica con aquellos cambios encontrados en los microarrays para los gnees THBS1, CTNNB1, CDH1, CDH2 Y MSLN. Se encontraron diferencias significativas para el gen THBS1 (p<0,046) entre el epitelio en contacto con el LP9 frente al epitelio control, y para el gen CTNNB1 (p<0,041) entre el estroma en contacto con LP9 frente al estroma control. Conclusiones: Los resultados revelan diferencias entre los perfiles de expresión de células estromales y epiteliales en contacto con el peritoneo frente a los controles de las células del estroma y del epitelio. La identificación de estos genes regulados diferencialmente se puede utilizar para comprender mejor la etiopatogenia de la endometriosis. Alteraciones en genes relacionados con el proceso biológico de adhesión celular pueden contribuir a las propiedades adhesivas e invasivas del endometrio ectópico, y los cambios en las vías de transducción de señales pueden apoyar un cambio en la comunicación entre células del tejido endometrial en contacto con el peritoneo en comparación con el tejido endometrial control. Estas familias de genes expresados diferencialmente ofrecen múltiples oportunidades para el desarrollo de nuevas hipótesis acerca de la endometriosis.