Micovirus en aislados de fusarium oxysporum f. Sp dianthicaracterización genómica y biológica

Resumen

1. Introducción o motivación de la tesis Fusarium oxysporum es el hongo fitopatógeno de suelo causante de la marchitez vascular, una enfermedad fúngica que origina importantes pérdidas económicas en una gran variedad de cultivos de interés agronómico. F. oxysporum f. sp. dianthi (Fod) es la ‘forma specialis’ que causa la fusariosis vascular en clavel. Actualmente no existe ningún método de control eficiente para esta enfermedad, y por ello diversos estudios se han dirigido a la búsqueda de nuevas herramientas de control, incluyendo la utilización de micovirus como agentes de control biológico de los hongos fitopatógenos. Los micovirus son virus que infectan hongos. Estos virus se han descrito infectando a la mayoría de grupos taxonómicos de hongos, incluyendo hongos fitopatógenos. La mayoría de estos virus poseen genomas de ARN, de doble cadena (dsRNA) o de cadena sencilla (ssRNA), aunque se han descrito unos pocos con genomas de ADN circular (ssDNA). Generalmente, los micovirus carecen de una vía de infección extracelular, y solo se transmiten entre aislados mediante anastomosis hifal (transferencia horizontal) o durante la producción de esporas (transferencia vertical). La mayoría de las infecciones por micovirus son crípticas, es decir, no tienen un efecto sobre su huésped fúngico, pero en algunos casos la infección viral se ha asociado a la alteración de determinados caracteres fenotípicos, siendo el de mayor relevancia la reducción de la virulencia (hipovirulencia). En estudios recientes se ha identificado el micovirus ‘Fusarium oxysporum f. sp. dianthi virus 1’ (FodV1), el cual parece inducir hipovirulencia en su hospedador. Este micovirus (FodV1) ha sido caracterizado molecularmente, habiéndose identificado en su genoma 4 segmentos, cada uno de los cuales posee un único marco abierto de lectura (ORF). La deducción de las secuencias aminoacídicas y su análisis filogenético ha indicado que se trata de un miembro de la familia Chrysoviridae. Además, se ha observado que el micovirus FodV1 presenta unos altísimos niveles de acumulación en su huésped. Estos resultados justifican la necesidad de seguir buscando micovirus en la colección de aislados de patógenos vasculares de Fusarium oxysporum f.sp. dianthi, caracterizarlos, determinar su prevalencia en las poblaciones de aislados fúngicos y analizar su efecto sobre el fenotipo de su huésped fúngico con el objetivo de poderlos usar como agentes de control biológico. 2. Contenido de la investigación En esta tesis se ha usado la microscopia laser confocal y dos cepas isogénicas de Fod, infectada y no infectada con FodV1, marcadas ambas con el gen que expresa la proteína fluorescente GFP, para analizar el efecto del micovirus sobre el patrón de colonización fúngica en el sistema vascular de la planta. Los resultados obtenidos han demostrado que la infección por FodV1 afecta a la densidad, dispersión, y distribución espacial de la colonización del hongo en la planta. Además, también se ha analizado la incidencia de infecciones por FodV1 en una colección de 221 aislados de Fod obtenidos entre 2008 y 2012 en la misma área geográfica que la cepa originalmente infectada, observándose finalmente una baja incidencia de la infección viral entre los aislados analizados (<2%). Como continuación de la búsqueda de micovirus con potencial como agentes de virocontrol de las fusariosis vasculares, en esta tesis se han identificado nuevos micovirus que se encuentran infectado aislados de Fod. El primer micovirus identificado y caracterizado molecularmente ha sido Fusarium oxysporum f. sp. dianthi hypovirus 2 (FodHV2). El genoma de FodHV2 tiene una longitud de 9,444 pb excluyendo la cola poli(A), y un único marco abierto de lectura (ORF) que codifica una poliproteína. Esta poliproteína contiene 3 dominios altamente conservados de UDP glucosa/esterol glucosiltransferasa (UGT), una polimerasa dependiente de ARN (RdRp) y una ARN helicasa viral (Hel). Además, se han identificado tres residuos de cisteína (Cys), histidina (Hys), y glicina (Gly), que podrían representar el sitio catalítico de una papain like-proteasa. La secuencia genómica completa de FodHV2 se ha comparado con la de otros micovirus en el género Hypovirus. Los resultados de esta comparación y del análisis filogenético apoyan la distinción, recientemente propuesta por otros autores, de tres géneros (Alphahypovirus, Betahypovirus, and Gammahypovirus) dentro de la familia Hypoviridae, e identifican a FodHV2 como un nuevo miembro del grupo de los Betahipovirus. El efecto biológico de FodHV2 en su aislado portador ha sido determinado utilizando dos cepas isogénicas, infectada y no infectada con FodHV2, obtenidas mediante transferencia horizontal del hipovirus via anastomosis hifal. La comparación de ambas cepas mostró que FodHV2 no tenía efecto sobre el crecimiento vegetativo, la conidiación, ni la virulencia de su aislado hospedador. FodHV2 es el primer hipovirus que se describe infectando una especie F. oxysporum, y además es el primero descrito en un aislado procedente de Africa. El segundo micovirus identificado en esta tesis ha sido el micovirus ‘Fusarium oxysporum f. sp dianthi mitovirus 1’ (FodMV1), detectado en un aislado de Fod procedente de Colombia. FodMV1 posee un genoma de 2,313 pb de longitud, en el que se ha identificado un único ORF que codifica una RdRp viral. Una búsqueda de homología usando la secuencia nucleotídica y el programa BlastX mostró que FodMV1 es un nuevo miembro del género Mitovirus en la familia Narnaviridae. Una de las características de los mitovirus es que se replican en la mitocondria. De acuerdo con esto, el genoma de FodMV1 presenta una serie de características comunes al resto de mitovirus, como son una alta concentración de A+U (58.8%) y la presencia de un número de codones UGA, que codifican el aa triptófano en vez de una ‘stop’ cuando se aplica el código genético mitocondrial. Asimismo, los extremos 5’- y 3’- UTR presentan una estructura secundaria característica también de mitovirus. El análisis filogenético sitúa a FodMV1 en un clado separado del resto mitovirus que infectan otras especies de Fusarium. FodMV1 parece tener una relativamente alta incidencia, ya que se ha identificado infectando a otros 22 aislados de Fod. Entre estos aislados infectados existen aislados procedentes de España (18) y Colombia (4). La presencia del mismo mitovirus en aislados de zonas geográficas tan separadas sugiere una dispersión de la infección viral a través de la comercialización de esquejes de clavel entre ambos países. 3. Conclusión Las conclusiones obtenidas en esta tesis doctoral han sido las siguientes: 1. El análisis mediante microscopia laser confocal, utilizando dos cepas isogénicas de F. oxysporum f. sp. dianthi, infectada y no infectada con el micovirus Fusarium oxysporum f. sp. dianthi Virus 1 (FodV1), demuestra que la infección por FodV1 produce una disminución en la velocidad y una restricción en la distribución espacial de la colonización fúngica en el interior de la planta. 2. El micovirus Fusarium oxysporum f. sp. dianthi Virus 1 presenta una baja incidencia en la colección de un total de 221 aislados fúngicos obtenidos en su misma área geográfica. Este dato podría sugerir una baja eficiencia en su transmisión. 3. Un nuevo micovirus, Fusarium oxysporum f. sp. dianthi hipovirus 2 (FodHV2), ha sido identificado infectando un aislado de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi procedente de Marruecos. La organización genómica, la presencia de determinados motivos conservados, y los análisis filogenéticos basados en alineamientos múltiples, identifican a FodHV2 como un nuevo miembro de la familia Hypoviridae, y lo sitúan agrupado con los miembros del aún no aprobado género Betahipovirus. 4. El genoma de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi hipovirus 2 tiene una longitud de 9,444 pb excluyendo la cola poli(A), y un único marco abierto de lectura que codifica una poliproteína. Esta poliproteína contiene 3 dominios altamente conservados de UDP glucosa/esterol glucosiltransferasa, una polimerasa dependiente de ARN, y una ARN helicasa viral. Además, se han identificado tres residuos de cisteína, histidina, y glicina en el extremo N-terminal, que podrían representar el sitio catalítico de una papain like-proteasa. 5. El análisis comparado de dos cepas isogénicas de F. oxysporum f. sp. dianthi, infectada y no infectada con FodHV2, muestra que este hipovirus no tiene efecto sobre el crecimiento vegetativo, la conidiación, ni la virulencia de su aislado hospedador. 6. El segundo micovirus identificado en esta tesis es Fusarium oxysporum f. sp dianthi mitovirus 1 (FodMV1), detectado en un aislado de F. oxysporum f. sp. dianthi procedente de Colombia. FodMV1 es un nuevo miembro del género Mitovirus en la familia Narnaviridae. 7. Fusarium oxysporum f. sp dianthi mitovirus 1 posee un genoma de 2,313 pb, en el que se ha identificado un único ORF que codifica una RdRp viral. FodMV1 presenta características comunes al resto de mitovirus derivadas de su replicación en la mitocondria, como son una alta concentración de A+U y la presencia de un número codones UGA, que codifican el aminoácido triptófano en vez de una señal de ‘stop’. 8. Los análisis filogenéticos sitúan a FodMV1 en un clado separado del resto de mitovirus descritos en otras especies de Fusarium, lo que lo señala como el más diferente al resto de mitovirus descritos en este género fúngico. 9. FodMV1 parece tener una alta incidencia, ya que se ha identificado infectando a otros 22 aislados de F. oxysporum f. sp. dianthi. Entre estos aislados infectados existen aislados procedentes de España y Colombia. La presencia del mismo mitovirus en aislados de zonas geográficas tan separadas sugiere una dispersión de la infección viral a través de la comercialización de esquejes de clavel entre ambos países. 10. Bibliografía • Garibaldi, A. (1978a). Alassio, Italia. Pp 69-88. • Garibaldi, A. (1978b). Alassio, Italia. Pp 69-88. • Baayen, R. P .(1988). Thesis. University of Utretcht, Holland. • Garibaldi, A., and Gullino, M. L. (1987). Phytopathology 77(12):1721-1721. • Gómez-Lama Cabanás, C., Valverde-Corredor, A., and Perez-Artes, E.( 2012). Eur. J. 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