Identificación y desarrollo de cereales aptos para personas con alergias e intolerancia al glutenmutagénesis dirigida mediante nucleasas específicas (crispr-cas9) de genes inmunodominantes en relación a la celiaquía

Laburpena

1. introducción o motivación de la tesis La producción agrícola mundial está dominada por tres cultivos de cereales: el trigo, el maíz y el arroz, de los cuales el trigo es el más ampliamente distribuido. La producción anual de trigo supera los 771 millones de toneladas (FAOSTAT, 2017), hallándose únicamente por debajo de la del maíz. Su amplia distribución y uso se debe a su gran adaptabilidad a diferentes entornos, su alto rendimiento, y a su versatilidad para la industria alimentaria, en al que se emplea para la fabricación de una gran variedad de alimentos de uso diario como pan, pastas, pasteles, fideos, galletas, etc. El trigo es también una fuente nutricional importante de carbohidratos complejos, proteínas y fibra dietética, así como de minerales, vitaminas y compuestos fitoactivos. El gluten, también presente en otras especies de la tribu Triticeae como la cebada y el centeno, representa alrededor del 80% de la proteína total del grano de trigo y confiere unas propiedades tecnológicas y biomecánicas únicas a la harina de trigo, las cuales son responsables de la calidad harino-panadera del trigo harinero. Sin embargo, el gluten no es una única proteína, sino una mezcla compleja de ellas, donde se incluyen las gliadinas (α-, ω- y γ-gliadinas), monoméricas, y gluteninas (HMW y LMW), poliméricas, que proporcionan viscosidad y elasticidad a la masa de trigo respectivamente. Las proteínas no pertenecientes al gluten (NGP) constituyen alrededor del 20% del contenido total de proteína de grano e incluyen una amplia gama de proteínas con funciones metabólicas y estructurales que juegan un papel secundario en la calidad del trigo. Dentro de las NGP se incluyen varios grupos de proteínas como α-amilasa/tripsina inhibidores (también conocidos como ATIs), inhibidor de serina proteasa (serpinas), proteínas de transferencia de lípidos (LTPs), β-amilasas, etc. Las proteínas del gluten también son responsables de desencadenar ciertas patologías. Las alergias e intolerancias relacionadas con el gluten incluyen la enfermedad celíaca (EC), la sensibilidad no celíaca al gluten/trigo (NCGS) y las alergias al trigo. La EC se define como una enteropatía autoinmune causada por la ingesta de gluten que se da en personas genéticamente predispuestas, afectando aproximadamente al 1% de la población de los países occidentales (Ludvigsson et al., 2013). Por el contrario, la NCGS no está bien definida, con síntomas que se superponen con los del EC y el síndrome del intestino irritable (SII) (De Giorgio et al., 2016). La prevalencia de la NCGS es difícil establecer debido a la falta de biomarcadores, realizándose su diagnóstico mediante la exclusión de otras patologías (Dale et al., 2019). No está totalmente claro si el agente causal de la NCGS es el gluten; estudios recientes han demostrado que los FODMAPs (oligosacáridos, monosacáridos, disacáridos y polioles fermentables) (Skodje et al., 2018) y algunas NGP del trigo, como los ATIs, parecen activar el sistema inmunitario innato (Junker et al., 2012) y, por lo tanto, desempeñan cierto papel en la NCGS. En el caso de la EC, existe un amplio conocimiento sobre los epítopos de gluten reconocidos por las moléculas HLA-DQ2 y HLA-DQ8 presentes en los individuos genéticamente predispuestos. El reconocimiento de ciertos péptidos por las moléculas HLA-DQ2/8 estimula la respuesta de las células-T, lo que en última instancia induce a una hiperplasia de las criptas y daños en las vellosidades intestinales además de varias complicaciones derivadas. Aunque existen epítopos de la EC en la fracción de las glutenina, la inmensa mayoría se encuentran en la fracción de las gliadinas (Arentz-Hansen et al., 2000), particularmente en las α-gliadinas que son las más inmunogénicas. En ellas se encuentra el 33-mer, conocido por ser el mayor complejo inmunogénico de la EC ya que contiene seis copias superpuestas de tres epítopos con propiedades altamente estimulatorias (Shan et al., 2002). Actualmente el único tratamiento para la EC es una estricta dieta sin gluten (DSG) mantenida de por vida. Aunque la DSG es también recomendada para los pacientes con NCGS, existen evidencias de que puede haber distintos niveles de tolerancia para esos pacientes (Roncoroni et al., 2019). Una DSG es difícil de seguir, socialmente inconveniente, costosa económicamente y además tiende a ser menos saludable, ya que es carece de varios componentes nutricionales importantes (Larretxi et al., 2019) además de contener mayores cantidades de grasas y azúcares con el objeto de imitar las propiedades viscoelásticas del gluten (Vici et al., 2016). Del mismo modo, la DSG también se asocia a efectos negativos sobre el microbioma intestinal beneficioso (De Palma et al., 2009). El desarrollo de cereales desprovistos de epítopos inmunogénicos es una posibilidad muy atractiva. Desafortunadamente este objetivo es casi imposible de alcanzar mediante mejora genética vegetal clásica, debido al alto número de copias de los genes que codifican para las proteínas del gluten y su elevada complejidad. En cualquier caso, diversas estrategias pueden aplicarse para la consecución de este objetivo, entre las que se incluyen: i) la búsqueda de variedades que de manera natural carezcan de epítopos de la EC y otros alérgenos, ii) el desarrollo de nuevos cereales con bajo perfil inmunogénico y iii) la aplicación de técnicas biotecnológicas para superar las limitaciones de la mejora clásica. El tritordeum es un nuevo cereal derivado del cruce entre una especie de cebada silvestre y un trigo duro (Martı́n et al., 1999), que difiere del trigo harinero en la composición del gluten, especialmente en lo que respecta a las gliadinas. Esto se debe a que el trigo duro carece del genoma D, donde se localizan los epítopos más importantes en relación con la enfermedad celíaca, y a que las variedades de cebada también contienen muy pocos péptidos inmunogénicos en comparación con el trigo, lo que convierte al tritordeum en un buen candidato como cereal con bajos niveles de péptidos inmunogénicos. A pesar de todos los esfuerzos, hasta el momento no se han identificado variedades de trigo que carezcan naturalmente de epítopos inmunogénicos. El desarrollo de la biotecnología, con técnicas como la transformación genética y el ARN de interferencia (ARNi), ha permitido silenciar los genes de fracciones específicas de gliadinas, además de los de todas las gliadinas, presentes en el grano de trigo (Barro et al., 2016). Algunas de las líneas de trigo ARNi mostraron una reducción en su capacidad estimulatoria de líneas de células-T específicas para la EC, mostrando así una ausencia de reactividad y la posibilidad ser empleadas en la fabricación de alimentos para pacientes celíacos (Pistón et al., 2013). Sin embargo, el silenciamiento de las gliadinas provocó un efecto compensatorio con otras fracciones proteicas (Pistón et al., 2013; García-Molina et al., 2017), aumentando el contenido de NGP. Esto último es particularmente importante debido a que determinadas proteínas pertenecientes a este grupo, como los ATIs, β-amilasas y serpinas, se han relacionado con los alérgenos del trigo (Volta et al., 2013). A lo largo de la última década el abanico de herramientas para la ingeniería genética se ha visto ampliado gracias a la incorporación de técnicas de edición de genes a través de nucleasas específicas de secuencia (SSN). Estas técnicas, entre las que se incluye CRISPR/Cas9, permiten cambios muy precisos en el genoma (Samanta et al., 2016) y se han convertido en una de las herramientas más poderosas para la edición de genes en las plantas. Sin embargo, los ejemplos de edición de caracteres importantes en cultivos con genomas poliploides complejos son todavía muy limitados. El objetivo general de este trabajo es la identificación y el desarrollo de cereales más saludables y que puedan ser aptos para las personas que sufren de alergias e intolerancias. Estos cereales tendrían indudables beneficios como la mejora del perfil organoléptico y nutricional de los alimentos para los pacientes con EC y NCGS, así como para la población en general que por cualquier motivo pretenda reducir la ingesta de gluten. Con este propósito hemos abordado la identificación y caracterización de nuevas variedades de cereales con perfil inmunogénico reducido y hemos aplicado las tecnologías de edición genética (CRISPR/Cas9) para editar el mayor complejo inmunogénico relacionado con la enfermedad celíaca. 2.contenido de la investigación Dadas las diferencias respecto al contenido en gluten del tritordeum con respecto al trigo, el presente trabajo incluye una evaluación del tritordeum como cereal alternativo para los pacientes que sufren de NCGS, para lo cual se he estudiado la respuesta al consumo de panes de tritordeum de un grupo de diez pacientes diagnosticados. De este modo se ha comprado si este nuevo cereal puede ser tolerado en su dieta. El ensayo se realizó en dos fases ("Fase Basal" y "Fase Tritordeum"), cada una de las cuales duró siete días. Se registraron tanto los síntomas gastrointestinales como la aceptación del pan de tritordeum en comparación con el pan sin gluten. No se presentaron cambios significativos en cuanto a los síntomas gastrointestinales de los sujetos entre las dos fases, y el pan de tritordeum tuvo mejor calificación que el pan sin gluten en cuanto a su aceptación, particularmente en términos de textura y sabor. Adicionalmente, se analizó el efecto del consumo de tritordeum en la microbiota intestinal de estos pacientes, debido a la reciente idea de que una disbiosis de la microbiota intestinal puede contribuir a la etiología y patogénesis de la NCGS. La composición y estructura de la microbiota intestinal se analizó mediante secuenciación del 16S, mostrando que, aunque la estructura y composición global de la microbiota intestinal de cada paciente era estable tras el consumo de pan de tritordeum, existe una tendencia al aumento de la abundancia relativa de algunas bacterias productoras de ácidos grasos de cadena corta, especialmente de Faecalibacterium. Este género de bacterias se conoce por su función productora de butirato, lo que sugiere beneficios saludables para la salud intestinal, ya que los butiratos contribuyen al mantenimiento de la barrera intestinal promoviendo la homeostasis intestinal y la tolerancia inmune. Se realizó un estudio comparativo del potencial estimulador de siete líneas de trigo ARNi, que difieren en la composición de las proteínas del grano (gluten y NGP) relevantes para la EC y otras patologías. Para ellos se realizó un análisis proteómico mediante cromatografía de líquidos de alta resolución en fase reversa y cromatografía liquida acoplada a espectrometría de masas. Estas líneas ARNi mostraron una reducción en el contenido total de gliadinas, mediante una reducción de sus fracciones especificas (particularmente de α-gliadinas para algunas líneas), además de un incremento en las HMW, y en el contenido de NGP como ATIs, serpinas y triticinas. Este estudio incluye, además, un análisis mediante células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de 35 pacientes con EC activa para evaluar la respuesta estimulatoria inducida por los extractos proteicos de las líneas de ARNi. El análisis de la proliferación celular y la liberación de INF-γ por parte de las PBMCs mostraron que la respuesta estimulatoria fue claramente diferente dependiendo de la línea ARNi. Esta respuesta estimulatoria fue particularmente baja en tres de las líneas, cuya respuesta no fue significativamente distinta a la del arroz usado como control negativo sin gluten. Estas líneas presentan un contenido muy bajo de gluten medido por el anticuerpo monoclonal G12, una pronunciada disminución de las α-gliadinas, mientras que el contenido en gluteninas fue variable entre las tres líneas. Las NGP no parecen jugar un papel relevante en la proliferación de las PBMCs y en la liberación de INF- γ. Adicionalmente se ha aplicado la tecnología CRISPR/Cas9 con el objetivo de editar la familia de las α-gliadinas, donde se encuentra el 33-mer. Las estimaciones del número de copias de los genes de α-gliadinas varían de entre 25-35 hasta incluso 100 copias por genoma haploide, lo que, junto con su gran complejidad, hace que esta familia de genes sea especialmente difícil para la edición genética. Se diseñaron dos ARN guías (sgAlpha-1 y sgAlpha-2) para editar una región conservada de los genes de α-gliadinas adyacente a la secuencia que codifica para el 33-mer. Se generaron 21 líneas mutantes (15 de trigo harinero y seis de trigo duro), las cuales mostraron una fuerte reducción en el contenido de α-gliadinas, así como en otros grupos de gliadinas. El análisis mediante secuenciación masiva demostró la alta eficacia del sistema CRISPR/Cas9 para producir mutaciones en esta compleja familia génica; hasta 35 genes diferentes, de los 45 identificados en la línea usada como control, fueron editados en una de las líneas; consiguiendo una reducción de la inmunoreactividad de hasta un 85% según los anticuerpos monoclonales R5 y G12. Algunas líneas se identificaron como libres de transgenes, y no se hallaron mutaciones “off-target” en otros genes. 3. Conclusión La inexistencia de cambios significativos en cuanto a los síntomas gastrointestinales de los sujetos entre las dos fases del ensayo con tritordeum sugiere que este nuevo cereal podría ser tolerado al menos por un subconjunto de pacientes con NCGS que no requieren la exclusión estricta del gluten y que así podrían beneficiarse de sus mejores propiedades organolépticas y nutricionales. Además, aunque la estructura y composición global de la microbiota intestinal de cada paciente era estable tras el consumo de pan de tritordeum, existe una tendencia al aumento de la abundancia relativa de algunas bacterias productoras de ácidos grasos de cadena corta, especialmente de Faecalibacterium. Este género de bacterias se conoce por su función productora de butirato, lo que sugiere beneficios saludables para la salud intestinal, ya que los butiratos contribuyen al mantenimiento de la barrera intestinal, promoviendo la homeostasis y la tolerancia inmune. Las líneas de trigo obtenidas mediante silenciamiento de distintos genes de prolaminas mediante ARNi muestras una capacidad estimulatoria reducida en la estimulación de PBMCs. Esta respuesta estimulatoria fue particularmente baja en tres de las líneas, cuya respuesta no fue significativamente distinta a la del arroz usado como control negativo sin gluten. Estas líneas presentan un contenido muy bajo de gluten medido por el anticuerpo monoclonal G12, con una pronunciada disminución de las α-gliadinas y sus epítopos. La proteína sin gluten no parece jugar un papel clave en la proliferación de PBMCs y en la liberación de INF-γ. La reducción del contenido de α-gliadinas mediante la tecnología CRISPR-Cas9 en el grano de trigo proporciona líneas de trigo duro y trigo harinero con una inmunoreactividad reducida para las personas intolerantes al gluten. Las líneas de trigo con bajo contenido en gluten y libres de transgenes descritas en este trabajo constituyen un avance sin precedentes, pudiéndose emplear para la producción de alimentos bajos en gluten además de servir como material de partida en programas de mejora vegetal para introducir este rasgo en variedades élite de trigo. 4. bibliografía Arentz-Hansen, H., Körner, R., Molberg, Ø., Quarsten, H., Vader, W., Kooy, Y.M.C., et al. (2000). The Intestinal T Cell Response to α-Gliadin in Adult Celiac Disease Is Focused on a Single Deamidated Glutamine Targeted by Tissue Transglutaminase. The Journal of Experimental Medicine 191(4), 603. doi: 10.1084/jem.191.4.603. Barro, F., Iehisa, J.C.M., Giménez, M.J., García-Molina, M.D., Ozuna, C.V., Comino, I., et al. (2016). Targeting of prolamins by RNAi in bread wheat: effectiveness of seven silencing-fragment combinations for obtaining lines devoid of coeliac disease epitopes from highly immunogenic gliadins. Plant Biotechnology Journal 14(3), 986-996. doi: 10.1111/pbi.12455. Dale, H.F., Biesiekierski, J.R., and Lied, G.A. (2019). Non-coeliac gluten sensitivity and the spectrum of gluten-related disorders: an updated overview. Nutrition Research Reviews 32(1), 28-37. doi: 10.1017/S095442241800015X. De Giorgio, R., Volta, U., and Gibson, P.R. (2016). Sensitivity to wheat, gluten and FODMAPs in IBS: facts or fiction? Gut 65(1), 169. doi: 10.1136/gutjnl-2015-309757. De Palma, G., Nadal, I., Collado, M.C., and Sanz, Y. (2009). Effects of a gluten-free diet on gut microbiota and immune function in healthy adult human subjects. British Journal of Nutrition 102(8), 1154-1160. doi: 10.1017/S0007114509371767. García-Molina, M.D., Muccilli, V., Saletti, R., Foti, S., Masci, S., and Barro, F. (2017). Comparative proteomic analysis of two transgenic low-gliadin wheat lines and non-transgenic wheat control. Journal of Proteomics 165, 102-112. doi: 10.1016/j.jprot.2017.06.010. Junker, Y., Zeissig, S., Kim, S.-J., Barisani, D., Wieser, H., Leffler, D.A., et al. (2012). Wheat amylase trypsin inhibitors drive intestinal inflammation via activation of toll-like receptor 4. Journal of experimental medicine 209(13), 2395-2408. doi: 10.1084/jem.20102660. Larretxi, I., Simon, E., Benjumea, L., Miranda, J., Bustamante, M.A., Lasa, A., et al. (2019). Gluten-free-rendered products contribute to imbalanced diets in children and adolescents with celiac disease. European Journal of Nutrition 58(2), 775-783. doi: 10.1007/s00394-018-1685-2. Ludvigsson, J.F., Leffler, D.A., Bai, J.C., Biagi, F., Fasano, A., Green, P.H., et al. (2013). The Oslo definitions for coeliac disease and related terms. Gut 62(1), 43-52. doi: 10.1136/gutjnl-2011-301346. Martı́n, A., Alvarez, J.B., Martı́n, L.M., Barro, F., and Ballesteros, J. (1999). The Development of Tritordeum: A Novel Cereal for Food Processing. Journal of Cereal Science 30(2), 85-95. doi: 10.1006/jcrs.1998.0235. Pistón, F., Gil-Humanes, J., and Barro, F. (2013). Integration of promoters, inverted repeat sequences and proteomic data into a model for high silencing efficiency of coeliac disease related gliadins in bread wheat. BMC plant biology 13, 136-136. doi: 10.1186/1471-2229-13-136. Roncoroni, L., Bascuñán, K.A., Vecchi, M., Doneda, L., Bardella, M.T., Lombardo, V., et al. (2019). Exposure to Different Amounts of Dietary Gluten in Patients with Non-Celiac Gluten Sensitivity (NCGS): An Exploratory Study. Nutrients 11(1), 136. doi: 10.3390/nu11010136. Samanta, M.K., Dey, A., and Gayen, S. (2016). CRISPR/Cas9: an advanced tool for editing plant genomes. Transgenic Research 25(5), 561-573. doi: 10.1007/s11248-016-9953-5. Shan, L., Molberg, Ø., Parrot, I., Hausch, F., Filiz, F., Gray, G.M., et al. (2002). Structural Basis for Gluten Intolerance in Celiac Sprue. Science 297(5590), 2275. doi: 10.1126/science.1074129. Skodje, G.I., Sarna, V.K., Minelle, I.H., Rolfsen, K.L., Muir, J.G., Gibson, P.R., et al. (2018). Fructan, Rather Than Gluten, Induces Symptoms in Patients With Self-Reported Non-Celiac Gluten Sensitivity. Gastroenterology 154(3), 529-539.e522. doi: 10.1053/j.gastro.2017.10.040. Vici, G., Belli, L., Biondi, M., and Polzonetti, V. (2016). Gluten free diet and nutrient deficiencies: A review. Clinical Nutrition 35(6), 1236-1241. doi: 10.1016/j.clnu.2016.05.002. Volta, U., Caio, G., Tovoli, F., and De Giorgio, R. (2013). Non-celiac gluten sensitivity: questions still to be answered despite increasing awareness. Cellular And Molecular Immunology 10, 383. doi: 10.1038/cmi.2013.28.