Determinación de anticuerpos anti-HLA por técnicas de fase sólida (Luminex) y su correlación con otros parámetros clínicos y con los efectos biológicos in vitro sobre linfocitos

Resumen

La relación entre la presencia de anticuerpos anti-HLA y el rechazo de los injertos trasplantados fue descrita por Terasaki en la década de los sesenta. Desde entonces, se han desarrollado diversas técnicas para la detección de estos anticuerpos. Recientemente se ha desarrollado una técnica que permite la detección de anticuerpos anti-HLA mediante un panel de esferas de colores recubiertas con antígenos HLA purificados, conocida como tecnología Luminex. A pesar de ser la técnica más sensible desarrollada hasta el momento, las consecuencias clínicas que tienen los anticuerpos anti-HLA detectados únicamente por este método se desconocen. Además, dado que el resultado de la tecnología Luminex es un valor numérico (semicuantitativo), es necesario correlacionar sus resultados con los de las tecnologías empleadas actualmente, para así poder conocer el valor clínico que ofrecen sus resultados. En esta tesis se ha correlacionado la tecnología Luminex con el crossmatch por citometría de flujo ya que es la técnica estándar más sensible utilizada actualmente. Para ello, se realizaron 179 crossmatch utilizando sueros estudiados por Luminex. En primer lugar, se realizaron 92 crossmatch en los que los sueros reconocían un único HLA en la célula utilizada y se comprobó que ambas técnicas se correlacionan con una r de 0,84. Además, se ha hallado un punto de corte en la tecnología Luminex que permite predecir el resultado de un crossmatch por citometría de flujo con una sensibilidad de 85% y una especificidad de 82%, teniendo un valor predictivo positivo y negativo del 84%. Dicho punto de corte es 6500 MFI de Luminex. A continuación, se realizaron 77 crossmatch en los que los sueros reconocían más de un antígeno HLA de la célula y los resultados se correlacionaron con la suma de intensidades de Luminex de dichas especificidades. Se comprobó que la correlación presentana una r de 0,81. También se comprobó que el punto de corte obtenido en el Luminex (6500 MFI) sigue siendo válido para estos casos y presenta una sensibilidad de 89% y una especificidad de 88%. Estos datos permiten utilizar el estudio de anticuerpos anti-HLA por la tecnología Luminex como crossmatch virtual, confiriéndole un evidente valor clínico, es decir, podría predecir el resultado de un crossmatch sin necesidad de disponer de células del donante. Esto permitiría una mejor selección de los receptores, reducir el tiempo de isquemia y facilitar el intercambio de órganos entre centros. Hay estudios en los que se ha documentado el papel de los anticuerpos anti-HLA como modificadores de distintos aspectos de respuestas linfocitarias in vitro. En estos trabajos, se han descrito efectos sobre inducción de apoptosis linfocitarias y proliferación sobretodo por anticuerpos monoclonales murinos que reconocen epítopos concretos de las moléculas HLA. Sin embargo, no se ha documentado la correlación de estos efectos biológicos con los niveles de anticuerpos detectados por técnicas de fase sólida (Luminex). En esta tesis se ha estudiado el efecto de anticuerpos anti-HLA presentes en sueros de pacientes sobre linfocitos activados in vitro. Para ello, se añadieron sueros de pacientes con distintos niveles de anticuerpos anti-HLA estudiados mediante la tecnología Luminex a un modelo de proliferación linfocitaria in vitro. Mediante la técnica de CFSE para citometría de flujo, se midió la proliferación linfocitaria en cada cultivo y se ha demostrado que una cantidad de anticuerpos con valor de 18000 MFI de Luminex es capaz de inhibir la proliferación linfocitaria in vitro. Estos datos pueden servir de base para futuros estudios que exploren los efectos de sueros de pacientes con anticuerpos anti-HLA sobre músculo liso y su relación con los mecanismos inmunológicos implicados en la evolución de los injertos.