Estudio cinematográfico de parámetros morfológicos del pre-embrión humano

Resumen

1- Introducción. El avance de las técnicas de Reproducción Asistida (RA) en las dos últimas décadas ha incrementado enormemente las tasas de éxito en cuanto a gestaciones conseguidas por Fecundación In Vitro (FIV); pero también ha supuesto el aumento alarmante de los embarazos múltiples, que tiene como consecuencia inmediata un mayor riesgo de partos prematuros y complicaciones en el embarazo y en el parto, y como factor secundario un aumento de los costes derivados de estos tratamientos. En los últimos años, las comunidades científicas, los gobiernos y las propias clínicas de RA, están realizando un gran esfuerzo para conseguir mantener las tasas de embarazo con un número menor de embriones transferidos. De hecho, en España, las gestaciones múltiples, entendidas como de 3 o más sacos, han disminuido drásticamente, puesto que más del 70% de las transferencias son dobles. En cuanto a las transferencias electivas de un solo embrión (eSET), ya suponen un 20% de los ciclos realizados y parece ser que la tendencia va en aumento. Una de las herramientas propuestas en los casos de eSET es la transferencia de embriones en estadio de blastocisto. Parece ser que la comunicación con el útero es mejor en este periodo de desarrollo, por lo que las posibilidades de implantar aumentan y la selección embrionaria es más exhaustiva, al disponer de más información. Para poder elegir bien el blastocisto a transferir, la introducción de nuevas técnicas en los laboratorios de FIV, como el video time-lapse, ha permitido conocer no solamente cómo se divide el embrión, sino cuándo y de qué manera, estableciendo diversos modelos morfocinéticos de selección. Con este sistema “cinematográfico” podemos valorar además parámetros que anteriormente, con las evaluaciones estáticas en los incubadores convencionales, no eran medibles. En este trabajo se han evaluado dos de estos parámetros: la contracción de los blastocistos y la aparición de vacuolas. 1.1- Contracción del blastocisto. La eclosión o “hatching” del blastocisto ocurre mediante dos mecanismos descritos en diferentes especies animales: la actividad enzimática y la contracción mecánica. En la especie humana, el proceso de contracción no ocurre en todos los embriones, ni la intensidad de las contracciones es la misma. Así como el tiempo de contracción es muy rápido, la re-expansión suele tardar horas. No se conocen exactamente los mecanismos por los que ocurre este proceso, aunque se sospecha que la pérdida repentina de líquido del blastocele puede ser debida a una brusca despolarización de la membrana y a la intervención de diferentes canales de iones, así como a la activación de miosina de cadena ligera y de los filamentos de actina. No se conoce con exactitud la repercusión en la calidad embrionaria ni en las posibilidades de implantación de los embriones que se contraen durante el tiempo previo a la eclosión, aunque estudios realizados en ratón sugieren que las contracciones fuertes suponen un mayor gasto de energía y pueden afectar al desarrollo posterior. 1.2- Aparición de vacuolas. La presencia de vacuolas en ovocitos y embriones es relativamente frecuente en los ciclos de R.A, y si bien se acepta que es una característica negativa en general, poco se sabe realmente acerca de su repercusión en la formación de blastocisto e implantación. Muchos de los trabajos publicados hablan de vacuolas sin definir número ni tamaño, y se suelen incluir en un apartado inespecífico de “inclusiones citoplasmáticas”. En las últimas recomendaciones de las sociedades científicas, sin embargo, ya se habla de diferenciar entre tamaño vacuolar y número de células vacuoladas, a la hora de clasificar el embrión. Gracias a los sistemas de video-time lapse, se ha podido comprobar además que la formación de vacuolas es un proceso dinámico en el tiempo, que aparece y desaparece o se agrava con la formación de nuevas vacuolas, y que dependiendo del número y tamaño la repercusión en la consecución de embarazo posiblemente varía. Sin embargo, poco o nada se sabe de por qué se forman las vacuolas en cigotos y embriones. Están implicadas en las rutas de transporte y digestión celular, y se ha revisado especialmente su formación y maduración en la endocitosis mediada por receptor y la autofagia, dos procesos fundamentales que aseguran la viabilidad de la célula. Se diría de hecho que son complementarios, puesto la endocitosis funciona en presencia de nutrientes, mientras que la autofagia se activa en tiempos de carencia de alimento. El tamaño de estas vacuolas suele ser de aproximadamente 1 µm de diámetro en mamífero, según los artículos publicados, y podrían corresponder a las vesículas que se observan en el citoplasma de algunos ovocitos y embriones, y que a veces se van fusionando a medida que el embrión se divide. Una disfunción en cualquiera de estas dos rutas, sin embargo, provoca a veces la alteración en la formación y tamaño de las vacuolas, que pueden aumentar su diámetro de forma anómala. También la digestión de grandes moléculas, como membranas nucleares, hace que el tamaño del fagosoma sea necesariamente mayor. La relación entre estos procesos y las células reproductoras también se ha estudiado, fundamentalmente en modelos animales. Parece ser que actúan de forma activa tras la fecundación, para, por un lado, proveer de nutrientes necesarios al cigoto en su importante transformación hacia embrión, y por otro eliminar orgánulos no necesarios para su evolución. La inhibición y/o supresión a nivel génico, lipídico y proteico de endocitosis y autofagia conduce a bloqueo embrionario en embriones y a disminución en el número de células de los blastocistos. La endocitosis aumenta en las células del trofoectodermo de los blastocistos y en estadios tempranos de gastrulación, para conseguir los nutrientes necesarios en estas etapas. Por tanto, la aparición de vacuolas de tamaño anómalo puede ser una respuesta ante situaciones de estrés, o incluso estar relacionada con procesos de apoptosis celular. 2- Hipótesis 2.1- La contracción de los blastocistos en los ciclos de FIV puede afectar a la calidad embrionaria y a la implantación. 2.2- La aparición de vacuolas a lo largo del cultivo embrionario de los ciclos de FIV puede afectar al desarrollo de los embriones, así como a su calidad y a las posibilidades de implantación, y que esta afectación puede estar modulada por el tiempo/estadio en el que aparecen, el número de células vacuoladas en el embrión y el propio tamaño de las vacuolas. 3- Objetivos. El objetivo general del presente trabajo se ha centrado en evaluar el efecto de la contracción de los blastocistos y de la aparición de vacuolas sobre la calidad embrionaria y la implantación. Los objetivos específicos han sido: 3.1- CONTRACCIÓN DEL BLASTOCISTO:  Relacionar la contracción del blastocisto con la implantación.  Relacionar el tiempo de aparición de las contracciones con la implantación.  Relacionar la duración de la contracción con la implantación.  Validar los resultados obtenidos con una segunda serie de datos. 3.2- APARICIÓN DE VACUOLAS:  Evaluar la distribución de la aparición de vacuolas a lo largo del desarrollo embrionario.  Relacionar la aparición de vacuolas con calidad embrionaria.  Relacionar la aparición de vacuolas con tasa de gestación e implantación.  Estudiar la presencia de vacuolas en el blastocisto  Evaluar la aparición de vacuolas en el subgrupo de 8 células a MC. 4- Material y métodos. Estudio retrospectivo realizado en IVI Valencia, IVI Murcia e IVI Zaragoza. Todos los procedimientos y protocolos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional, que regula los análisis de la base de datos y los procedimientos clínicos de FIV para la investigación en IVI. Este proyecto cumple también con la Ley Española que regula las tecnologías de Reproducción Asistida (14/2006). Los datos presentados forman parte del Proyecto 1404/VLC/014/YM aprobado por el CEIC (Comité ético de investigación clínica) con fecha de dictamen: 14 Julio 2014. En una primera serie de datos (SERIE 1) se evaluó la relevancia clínica de las contracciones en los blastocistos. (460 transferencias, 715 blastocistos transferidos, 502 embriones KID, medio de cultivo secuencial a 20% O2) En una segunda serie de pacientes de donación de ovocitos, y bajo condiciones de cultivo diferentes, se analizaron de nuevo las contracciones, para confirmar los resultados obtenidos en la primera serie y se evaluó además un nuevo factor dinámico: la aparición de vacuolas en ovocitos y embriones (SERIE 2) (340 transferencias, 1354 embriones analizados, 499 blastocistos transferidos, 376 KID, medio de cultivo continuo a 5% CO2). 5- Resultados. 5.1- Contracción del blastocisto. Las características descriptivas de las pacientes con blastocistos contraídos fueron perfectamente comparables con las que no, exceptuando la media de embriones transferidos, que resultó ser estadísticamente mayor en el grupo de transferencias con al menos un blastocisto contraído (1,7 vs 1,5, p=0,001). Puesto que también se observa que hay significativamente más transferencias de ciclos de donación de ovocitos en el grupo que presenta contracciones, esta diferencia podría ser debida a que en las fechas en las que se realizaron las transferencias embrionarias (Junio del 2012-Mayo del 2013) la transferencia de un blastocisto en este tipo de ciclos comenzaba a practicarse, pero lo habitual era transferir dos embriones. Otra posible causa podría ser que la calidad embrionaria fuera peor en el grupo de embriones contraídos y se necesitara transferir un número mayor de embriones. Sin embargo, no se han encontrado diferencias entre los grupos cuando se compara la calidad en D+2, D+3 y D+5. Tampoco se encuentran diferencias entre estos dos grupos cuando se evalúa la tasa de BHi (28,7% no contraídos vs 31,4% contraídos, NS). Parece ser por tanto que la contracción del blastocisto no favorece el hatching del blastocisto. [...]