Medida de la influencia del hábito fumador de las madres sobre la inestabilidad genética de sus hijos determinada mediante ensayo de micronúcleos

Resumen

TITULO: MEDIDA DE LA INFLUENCIA DEL HABITO FUMADOR DE LAS MADRES SOBRE LA INESTABILIDAD GENÉTICA DE SUS HIJOS DETERMINADA MEDIANTE ENSAYO DE MICRONUCLEOS RESUMEN: El tabaquismo es causa de un gran número de patologías respiratorias, cardiovasculares y oncológicas. Actualmente se continúan estudiando mecanismos metabólicos, genéticos y celulares que modifican la susceptibilidad individual a los carcinógenos presentes en el humo del tabaco. El consumo de tabaco en la mujer constituye un grave problema, por incrementar y por repercutir en fertilidad y gestación. 12-20% de las mujeres fuman durante la gestación. La capacidad carcinogénica del tabaco depende de la activación de sus componentes sólidos neutros (benzopireno) por enzimas orgánicas (CYPlAl, GSTs); activados son capaces de establecer uniones de alta afinidad con el ADN, originando alteraciones moleculares y alteraciones celulares. El gen TP53 es el más frecuentemente mutado en los tumores esporádicos humanos, con una prevalencia de 70% en el cáncer de pulmón. Los micronúcleos (MN) son cuerpos citoplasmáticos de naturaleza nuclear, material genético no incorporado correctamente a células hijas durante la división, reflejan inestabilidad genética. Se han incluido 143 muestras de sangre de cordón umbilical procedentes de la Clínica Universitaria de Navarra y del Hospital virgen del Camino previo consentimiento informado. Las muestras se clasificaron en función del hábito fumador materno. Se caracterizaron mediante pcr-DGGE los exones 5 a 8 del gen TP53 y se analizó el polimorfismo R72P del exón 4 asociado con cáncer de pulmón mediante pcr-rflp. Se determinaron los genotipos para los polimorfismos de las enzimas metabolizadoras y detoxificadoras de drogas: gen CYPlAl y los genes GSTM y GSTT. El estudio celular se basó en el ensayo de MN, se aislaron los linfocitos de la sangre de cordón, se sembraron in vitro en condiciones óptimas para i ni car la división celular y a las 44 h se añadió citocalasina-b para impedir la citocinesis y obtener células binucleadas, a las 28 h se incia el cosechado celular con soluciones fijadoras y se tiñen las preparaciones. Se realizó un ensayo con sangre procedente de donante no fumadora para realizar una validación interna y observar el efecto del compuesto activo del bp (bpde) sobre n°MN y apoptosis y determinar la mínima dosis capaz de inducir un incremento significativo de MN. El número de MN de las muestras de sangre fetal procedentes de madres fumadoras durante el embarazo era significativamente superior al de las muestras procedentes de madres no fumadoras (p=0,016). Los genotipos polimórficos del gen TP53 y de las enzimas metabolizadoras de drogas se asociaban con mayor índice de MN sin alcanzar significación estadística. El sexo de los recién nacidos, edad materna y exposición a tóxicos fue estudiada, el sexo femenino y las muestras procedentes de madres con edades superiores a 35 años presentaban mayor n°MN sin alcanzar significación estadística. La validación interna del ensayo con dosis escaladas de bpde in vitro sobre cultivo reveló que es un agente capaz de inducir MN y apoptosis sobre linfocitos y la mínima dosis con efecto visible era 12,5 nM. El análisis mutacional de los exones 5, 6, 7 y 8 del gen TP53 reveló la presencia de cuatro patrones electroforéticos alterados en las 143 muestras (2,8%); de las cuales, una procedente del grupo de madres fumadoras presentó una mutación de cambio de sentido en el exón 8 (R283C) y las tres restantes resultaron portadoras del polimorfismo R213R del exón 6 del gen TP53. El incremento significativo de MN en muestras fetales procedentes de madres que fumaban activamente durante la gestación frente a las no fumadoras indica que el hábito fumador incrementa la inestabilidad genética de los hijos y este incremento puede ser detectado mediante el ensayo de MN. Los genotipos de susceptibilidad para el gen TP53 y los pertenecientes a las enzimas metabolizadoras y detoxificadoras de drogas pueden considerarse factores modificadores pero no influyen significativamente en el número de MN detectados en sangre fetal