Estudios de seguridad en la utilizacion de celulas madre limbocorneales autologas cultivadas in vitro en el tratamiento de la insuficiencia limbica

Resumen

#TITULO: ESTUDIO DE SEGURIDAD EN LA UTILIZACIÓN DE CÉLULAS MADRE LIMBOCORNEALES AUTOLOGAS CULTIVADAS IN VITRO EN EL TRATAMIENTO DE LA INSUFICIENCIA LIMBICA #RESUMEN: Nuestro trabajo se ha basado en dos partes: un estudio de experimentación animal, llevado a cabo con conejos de raza New zealand, y un estudio de cultivo celular, basado en el cultivo de anillos limbocorneales. l. Cultivo celular Puesto que la finalidad última del proyecto es desarrollar una estrategia terapéutica con células madre que permita tratar enfermos con insuficiencia límbica, es fundamental desarrollar y optimizar la técnica de cultivo, expansión y caracterización de células madre obtenidos del epitelio limbocorneal humano. El cultivo celular lo hemos llevado a cabo con diez anillos limbocorneales de donante humano y seis anillos limbocorneales de conejo. Hemos comparado tres métodos de cultivo diferentes: sobre membrana amniótica, sobre placa y un cultivo combinado (una primera parte de cultivo sobre placa y una segunda parte de cultivo sobre membrana amniótica). La comparación de los tres métodos de cultivo la hemos hecho basándonos en el análisis de marcadores inmunohistoquimicos. Los marcadores analizados han sido las cito queratinas 3/12 y 14, la proteína nuclear p63 y la conexina 43. 2. Experimentación animal Cuando ocurre una insuficiencia límbica (por daño parcial o completo de las células madre limbocorneales) el epitelio conjuntival invade la superficie corneal produciendo una conjuntivalización de la superficie corneal con neovascularización fibrosis, irregularidades corneales, etc. con la consiguiente pérdida de visión. En las situaciones de insuficiencia límbica completa el trasplante corneal no es suficiente como tratamiento, es necesario conseguir una regeneración previa del epitelio corneal. Diversos estudios han demostrado que es posible cultivar células madre limbocorneales in vitro (tanto a partir de animales como humanos) y que estos cultivos generan mediante duplicaciones simétricas nuevas células madre y mediante diferenciación asimétrica tanto TAC como epitelio corneal diferenciado. Basándose en estos estudios, se han desarrollado técnicas de tratamiento de la insuficiencia limbica mediante el trasplante de células madre. El trasplante de células limbocorneales autólogas se utiliza en situaciones de insuficiencia unilateral, obteniendo el fragmento limbocorneal del ojo sano contralateral. La posibilidad de cultivar células madre limbocorneales in vitro permite cultivar y expandir células a partir de una mínima biopsia limbocorneal, lo que reduce el riesgo del ojo donante. lnicialmente hemos analizado dos modelos de causticación corneal con el objetivo de inducir una insuficiencia límbica completa. Hemos estudiado dos grupos de 10 animales a cada uno de los cuales hemos aplicado dos modelos de causticación corneal diferentes. Se han seguido durante dos meses hasta el sacrificio, procediendo al análisis histológico de los ojos enucleados. El segundo grupo de animales está formado por tres grupos de diez conejos. Les hemos aplicado a todos los animales en modelo de causticación corneal en uno de los ojos con el objetivo de inducir una insuficiencia límbica completa. Diez animales no han recibido tratamiento y han servido como grupo control. Diez animales, dos semanas tras aplicar el modelo de causticación corneal, se han tratado con trasplante de membrana amniótica. Los diez animales restantes, dos semanas tras el modelo de causticación corneal, se han tratado con trasplante de limbo. Es seguimiento ha sido de dos meses. El tercer grupo de estudio está constituido por treinta animales divididos en dos grupos de quince a los cuales se les ha aplicado unilateralmente el modelo de causticación corneal. Quince animales no se han tratado, sirviendo como grupo control. Los otros quince animales, dos meses después del modelo de causticación, se han tratado con cultivo de células limbocorneales sobre membrana amniótica, obtenidas a partir de un fragmento limbocorneal obtenido del ojo contralateral sano. Este grupo se ha seguido durante seis meses hasta el sacrif