Sintesis de Di-2',3'-dideoxinucleósidos polifosfatos catalizada por luciferasa de luciérnaga y T4 dna ligasa exploración del metabolismo de los (2', 3'-dideoxi) nucleótidos

Résumé

En este trabajo se describe la síntesis in vitro de dinucleósido polifosfatos (NpnNs) y sus 2',3'-dideoxiderivados (ddNpnddN) catalizada por la luciferasa de luciérnaga (EC 1.13.12.7) y por la T4 DNA ligasa (EC 6.5.1.1). Se analizan también los intentos de introducir dinucleótidos en el interior de las células. La síntesis relativa de diadenosina tetrafosfoto (Ap4A) catalizada por luciferasa de luciérnaga a partir de ATP es unas 100 veces más rápida que la de di-2',3'-dideoxiadenosina tetrafosfato (ddAp4ddA) a partir de ddATP. En presencia de ATPyS y ddATP la producción de Ap4ddA es similar a la de Ap4A en presencia de ATP. Esto indica que el grupo 3'-OH de la ribosa es esencial para la formación del complejo luciferasa-luciferil-AMP y explica el bajo rendimiento en la síntesis de ddAp4ddA en presencia de luciferasa, luciferina y ddATP. La importancia del residuo 3'-OH de la ribosa se investigó adicionalmente explorando las reacciones catalizadas por la fosfodiesterasa de verano de serpiente, dinucleósido tetradosfatasa, adenilato quinasa, adenosina deaminasa, apirasa, 6-fosfofructoquinasa y hexoquinasa. En general se encuentran valores de Vmax inferiores y de Km superiores cuando se usan los 2'-deoxi o 2',3'-dideoxi derivados de los substratos naturales. El Ap4ddA se hidreoliza por la fosfodiesterasa y dinucleósido tetrafosfatasa preferentemente a AMP + ddATP. Este hallazgo abría la posibilidad de usar Ap4ddN como una fuente directa de ddNTP, el agente activo de los 2',3'-dideoxinucleósidos (ddN) en la terapia de algunos tumores e infecciones virales. Basado en lo anterior, se exploró la posibilidad de introducir (di)nucleótidos en el interior de células de hepatoma de rata o en Saccharomyces cerevisiae, usando liposomas o electroporación. Finalmente, la T4 DNA ligasa (EC 6.5.1.1), uno de los enzimas más ampliamente utilizados en ingeniería génetica, transfiere AMP del complejo E-AMP al tripolif