Desregulación del splicing del gen PALB2 en cáncer de mama hereditario

Resumen

El cáncer de mama continúa siendo un problema de salud pública a escala mundial, situándose como el cáncer más diagnosticado en mujeres y ocupando el segundo lugar entre las causas de muerte por cáncer en este grupo. La capacidad para identificar y diagnosticar el cáncer de mama ha mejorado notablemente en los últimos años y recientemente estudios de secuenciacion a gran escala han demostrado como variantes de pérdida de función en al menos 8 genes (BRCA1, BRCA2, PALB2, BARD1, RAD51C, RAD51D, ATM y CHEK2) confieren un alto riesgo de desarrollar esta enfermedad (Dorling et al., 2021). En esta tesis doctoral, presentamos los resultados del análisis funcional de las variantes de splicing del gen PALB2 detectadas en más de 113.000 mujeres del proyecto de secuenciación a gran escala BRIDGES (Breast Cancer After Diagnostic Gene Sequencing; https://bridges-research.eu/). En este proyecto se analizaron ochenta y dos variantes de PALB2 en los límites intrón-exón con MaxEntScan y a continuación, se seleccionaron 44 variantes para su posterior ensayo funcional de splicing. Para este propósito, se construyeron tres minigenes de splicing que comprenden los exones 1-12. Las 44 variantes potencialmente espliceogénicas se introdujeron en los minigenes mediante mutagénesis dirigida y se ensayaron en células MCF-7 / MDA-MB-231. Treinta y cinco de las 44 variantes alteraron el splicing, de las cuales 25 no mostraron rastros o mostraron cantidades mínimas de transcrito full-length. Se caracterizaron 33 transcritos aberrantes producidos por diferentes variantes, 23 de las cuales predecían el truncamiento de la proteína PALB2. Asimismo, se analizaron con MES 151 variantes reportadas en ClinVar de las fronteras intrón-exón de PALB2, de las que 67 fueron seleccionadas para estudios funcionales, y 11 fueron ensayadas en el mgPALB2_ex1-3. Todas las variantes ensayadas alteraron el splicing, de las cuales 10 no revelaron la presencia del transcrito canónico. Por otro lado, se realizó un mapeo funcional mediante microdeleciones donde se identificaron 3 zonas ricas en ESEs de los exones 11 y 12 de PALB2: c.3143-c.3171, c.3229-c.3258 y c.3293-c.3322 y se ensayaron funcionalmente 9 variantes reportadas por ClinVar y localizadas en estos intervalos. Ocho de ellas alteraron el splicing. Por ultimo queremos recalcar la sensibilidad y precisión de los ensayos funcionales de splicing con minigenes como estrategia para la caracterización inicial de las variantes de splicing y la posterior interpretación clínica de las variantes de cualquier enfermedad genética. La desregulación del splicing es uno de los principales mecanismos de inactivación génica en enfermedades hereditarias. Además, la gran mayoría de las variantes estudiadas alteraron el splicing (56/64, 87,5%), destacando que 31 fueron clasificadas como patogénicas reduciendo el porcentaje de variantes BRIDGES clasificadas como VUS reportadas por ClinVar, del 57% de VUS-ClinVar al 23% incluyendo nuestros resultados.