Análisis transcriptómico del remodelado de la homeostasis del calcio intracelular en cáncer de colon

Resumen

El cáncer de colon, en 2020, ocupó, a nivel mundial, el tercer puesto en incidencia y el segundo en mortalidad. Se han descrito 10 características o hallmarks que distinguen a las células normales de las tumorales: autonomía proliferativa, resistencia a la muerte, capacidad migratoria y metastásica. La forma más frecuente de aparición de este es a través de alteraciones en la ruta Wnt/β-catenina, lo que puede dar lugar a un aumento de la síntesis de poliaminas las cuales, en condiciones normales, participan en diferentes procesos como la restitución epitelial e, incluso, en la regulación de la homeostasis del calcio intracelular. Es más, algunos de los hallmarks del cáncer están estrechamente relacionados con los sistemas de transporte del calcio intracelular. El calcio intracelular es un ion sumamente importante en numerosos procesos celulares, tales como la contracción muscular, proliferación celular, muerte celular, migración celular… Por ello, los sistemas de transporte intracelular de este ion han de estar celosamente regulados. Existen diferentes mecanismos celulares de transporte de calcio, aparte de depósitos intracelulares de este con sus correspondientes sistemas de transporte. En las células epiteliales, como son los colonocitos, el sistema de transporte más importante de calcio es la “Entrada Capacitativa de Calcio” , desregulada en el cáncer de colon. No obstante, aunque a nivel funcional se ha descrito que los sistemas de transporte de calcio están desregulados, los mecanismos moleculares que subyacen a estos cambios todavía no se conocen con detalle. Por todo ello, la presente tesis trata de aclarar algunas de las bases moleculares implicadas en la transformación tumoral y en las características de estas células, para lo que se ha empleado el análisis transcriptómico en diferentes modelos de colon normal y tumoral humano. En primer lugar, en modelos celulares se ha estudiado la homeostasis del calcio intracelular tanto a nivel transcriptómico, para lo que se han empleado diferentes técnicas de alto rendimiento, como a nivel funcional mediante la técnica de imagen de calcio. En estos mismos modelos, y de un modos similar, se estudio el efecto sobre la homeostasis del calcio intracelular de la depleción de poliaminas inducida por el tratamiento con DFMO, un inhibidor suicida de la síntesis de poliaminas. Posteriormente, para estudiar el transcriptoma de modelos más cercanos a la realidad del cáncer de colon, se estudió el transcriptoma de muestras pareadas de cáncer de colon y normal donadas por 10 pacientes diferentes junto con la expresión de proteínas seleccionadas por western blotting. Finalmente, a partir del reanálisis de diferentes experimentos transcriptómicos extraídos de repositorios públicos junto con los obtenidos por nuestro grupo se realizó un metaanálisis de más de 1000 microarrays de muestras de tejido humano de cáncer de colon y normal, pues estos resultados reflejarán más fielmente la realidad de los cambios transcriptómicos que subyacen al cáncer de colon humano. De los modelos celulares se obtuvo que, en el cáncer de colon, los mecanismos de transporte de calcio están profundamente alterados tanto a nivel transcriptómico (56 genes diferencialmente expresados) como a nivel funcional, pues se ha observado que las células tumorales, respecto de las normales, presentan una mayor concentración de calcio libre intracelular, un menor tamaño de los depósitos y una mayor entrada capacitativa. El análisis transcriptómico triple realizado ha detectado la sobreexpresión de 24 genes implicados en transporte de calcio en las células tumorales: los canales CAV1.3, ORAI2 (y sus reguladores STIM1, MBP, y las SEPTIN2,4,7,9-11), TRPC5, TRPV6, TRPM7 y TRPP1, las bombas PMCA1, SERCA2, SPCA2, el intercambiador NCX2, los canales intracelulares IP3R1 e IP3R3, el uniportador de calcio mitocondrial MCU, su modulador MICU1, MCUR1, y el canal VDAC2 de la membrana mitocondrial externa, junto con la infraexpresión de 32 genes incluyendo los canales CAV1.2, CAV2.2 y CAV2.3, ORAI1 (y sus moduladores ORMDL3, SARAF, CRACR2A y las SEPTIN1,3 y 6), TRPC7, TRPP2,3 y 5, TRPM2,3,5 y 8, TRPV1, TRPA1 y TRPML1,2 y 3, las bombas PMCA4 y SPCA1, los canales intracelulares IP3R2 y RyR2, los reguladores negativos de la captación de Ca mitocondrial MICU2 y MCUb, los canales de la membrana mitocondrial externa VDAC1 y 3 y el intercambiador mitocondrial NCLX. En cuanto al tratamiento con DFMO sobre estos mismos modelos, se observó un efecto casi selectivo sobre las células tumorales frente a las normales. Por un lado, a nivel transcriptómico se han identificado más de 4000 genes diferencialmente expresados en las células tumorales frente a los, únicamente, 165 identificados en las normales. De estos, en las células tumorales se han identificado 16 relacionados con la homeostasis del calcio intracelular y sólo 1 en las normales. Cabe destacar que de estos 16 genes diferencialmente expresados en las células tumorales, 10 revierten la expresión diferencial mostrada entre las células tumorales y normales en condiciones control. Específicamente, DFMO disminuye la expresión de TRPC5, TRPV6, TRPP1 y SPCA2 que estaban sobrexpresados en las células tumorales, a la vez que aumenta la expresión de CRACR2A, ORMDL3, SEPTIN6, TRPP2, PMCA4 y VDAC3 que estaban infraexpresados en las células tumorales. En cambio, en las células normales, DFMO solo modula la expresión de un único gen, el canal intracelular IP3R1. El análisis en muestras pareadas procedentes de 10 pacientes muestra, como era de esperar, un menor número de cambios en el transcriptoma, destacando los cambios consistentes con el aumento de la captación mitocondrial de calcio en el fenotipo tumoral. Finalmente, el metaanálisis, mostró un evidente remodelado de la homeostasis del calcio intracelular que difería en buena medida de los cambios observados en los modelos celulares y las muestras pareadas. Los cambios coinciden en 19 genes incluyendo CAV1.3, CAV3.2, ORAI2, SARAF, las SEPTIN1,2,4,6,7,9, TRPV1, TRPML1,2, TRPM5, TRPM8, TRPA1, PMCA4, MICU2 y NCLX. Respecto a las muestras pareadas, los datos del metaanálisis coinciden en solo 10 genes incluyendo el canal específico de tejido MS4A12, los moduladores de SOCE STIM1 y las SEPTIN1,2,6 y 7, los canales TRPM1, la bomba SPCA1, el canal del retículo IP3R1 y el canal mitocondrial VDAC1. Finalmente, en los tres análisis llevados a cabo solo coinciden 4 genes, las SETPIN1,2,6 y 7. En conclusión, tanto en los modelos celulares como en los de tejido humano, el fenotipo tumoral está asociado con una evidente dishomeostasis del calcio intracelular que, curiosamente, difiere notablemente entre los distintos modelos. Además, la depleción de poliaminas afecta casi en exclusiva a las células tumorales pero no a las normales, de tal manera que consigue revertir parcialmente el fenotipo tumoral tanto a nivel transcripómico como a nivel funcional.