Implicaciones del estrés oxidativo en la etiopatogenia del pterigión

Resumen

INTRODUCCIÓN El pterigión es una enfermedad caracterizada por la aparición de una neoformación fibrovascular triangular sobre la córnea. Etimológicamente deriva del griego pterygos, que significa ¿ala¿. Se caracteriza por la presencia de un epitelio poliestratificado no queratinizado dispuesto sobre un tejido conectivo altamente vascularizado. Típicamente aparece en el lado nasal debido, supuestamente, al enfoque de la mayor parte de la luz solar incidente específicamente sobre el limbo esclero-corneal medial. Mayoritariamente no manifiestan sintomatología, pero puede provocar sensación de cuerpo extraño, lagrimeo o incluso dolor. La visión puede afectarse indirectamente si el crecimiento del pterigión altera suficientemente la córnea como para modificar el astigmatismo, o, en casos severos, directamente si crece hasta afectar al eje visual. Su incidencia es muy variable dependiendo de la población estudiada, en concreto en España un estudio reciente de Viso y colaboradores en 2011 mostraba una incidencia del 5,9%. Su tratamiento es quirúrgico, con o sin la adición de tratamientos coadyuvantes como la mitomicina C o la aposición de un autoinjerto de conjuntiva-limbo. Tras su extirpación presenta una alta tasa de recurrencia, siendo uno de los problemas más importantes que acucian al oftalmólogo. Dependiendo del tratamiento empleado presenta recidivas muy diversas, ha sido publicada de hasta del 89 % en el estudio de Singh y colaboradores en 1988, sin el uso de coadyuvantes, y de cerca del 4% con el uso de autoinjerto de conjuntiva y mitomicina C, por Cardillo y colaboradores en 1995. La patogenia del pterigión no es conocida en su totalidad. Pero parece demostrado que el papel de la radiación ultravioleta (UV) en la etiopatogenia del pterigión es fundamental. En múltiples estudios se ha relacionado no solo la incidencia y la distribución geográfica del pterigión con la radiación UV si no que se ha explicado también la aparición selectiva en la zona nasal o los cambios histológicos que se observan en el pterigión. Es conocido que la radiación UV puede provocar daño en los tejidos tanto de forma directa, por fototoxicidad, como indirectamente, a través de distintos intermediarios, como son los radicales libres, la angiogénesis o la alteración del ciclo celular. El pterigión es una patología compleja que comparte muchas características con los tumores, tales como la proliferación celular, la invasión de la córnea y la recurrencia después de la resección. Se ha relacionado al pterigión con una angiogénesis activada, prueba de ello es la aparición de una microdensidad vascular aumentada y la sobreexpresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Sin embargo, es destacable el fracaso de los tratamiento anti-VEGF, como el bevacizumab, en el tratamiento del pterigión como se ha visto en recientes publicaciones. Dentro de la alteración del ciclo celular se ha observado tanto una reducción de la muerte celular programada (apoptosis) como un aumento de la proliferación celular. La proliferación se encuentra aumentada como evidencian algunos estudios sobre la incapacidad del gen de supresión tumoral p53 para frenar la proliferación, así como el aumento del marcador de proliferación Ki-67. La apoptosis se ha asociado con el pterigión en estudios que ponen de manifiesto un aumento de la expresión del brazo antiapoptótico de la familia Bcl-2 así como la reducción de las células en apoptosis visualizadas según la técnica Tunel, sin embargo no existe un aumento en la expresión de la caspasa-3 en tejido de pterigión, lo que indica implicación de otras vías. El daño celular causado por especies reactivas del oxígeno y el nitrogeno, se produce en los sistemas biológicos debido a una inadecuada eliminación de los radicales libres, que resulta en la acumulación de macromoléculas químicamente alteradas. Las proteínas, los ácidos nucleicos y particularmente los ácidos grasos poliinsaturados, que constituyen parte de las membranas biológicas, son vulnerables a la oxidación por radicales libres. Los peróxidos lipídicos formados de este modo se acaban degradando a aldehídos derivados de lípidos, tales como malondialdehído (MDA), y 4-hidroxinonenal (HNE), entre otros. Estos se han visto relacionados con la patogénesis de varias enfermedades tales como diabetes, envejecimiento, retinopatía del prematuro, queratocono, etc. Los productos de la peroxidación lipídica son capaces de producir toxicidad mediante la inducción de metabolitos de señalización pro-apoptóticos a través de múltiples vías e incluso también por necrosis. La concentración intracelular de 4-HNE se ha descrito que es crucial para la señalización del ciclo celular y puede ser un factor determinante para la diferenciación, proliferación, transformación, o la apoptosis. Además, HNE ha sido reportado anteriormente como posible regulador de la expresión de VEGF en las células del epitelio pigmentario de la retina. También ha sido demostrada la expresión conjunta del gen supresor p53 y de 8-hydroxydeoxy-guanosina (uno de los productos principales de la oxidación del ADN) en el tejido de pterigión, lo que sugiere una posible implicación del estrés oxidativo en esta enfermedad. Por otra parte la aparición de un desequilibrio redox se pude producir una reducción de los metabolitos antioxidantes, como son el glutatión y la superoxido dismutasa. La importancia de la familia del glutatión radica en la capacidad para eliminar radicales hidroxilo en presencia de glutatión reducido (GSH), con la formación de agua y glutatión oxidado. Por otra parte la superoxido dismutasa (SOD) es capaz de transformar el radical superoxido en radicales hidroxilo (OH.), por lo que precisa en su vecindad otro antioxidante que neutralice al radical hidroxilo, como por ejemplo la glutatión peroxidasa o la catalasa. MATERIAL Y MÉTODOS Se obtuvieron muestras de conjuntiva procedentes de la extirpación quirúrgica de pterigión primario de 32 pacientes (17 hombres y 15 mujeres), con edad media de 32.3 ± 4,5 años y sin patología sistémica ni oftalmológica de interés. Todos los pacientes se sometieron a la extirpación quirúrgica del pterigión, combinando la técnica de escisión el pterigión con amplia disección del tejido hipertrófico subconjuntival junto con el autoinjerto conjuntival, en la Fundación Oftalmológica del Mediterráneo (FOM), Valencia, España. Todas las lesiones se localizaron en el lado nasal y sólo la cabeza del pterigión primario se utilizó como muestra pterigión. Las muestras de conjuntiva normal fueron consideradas como controles, y se obtuvieron de la conjuntiva medial interpalpebral de 35 pacientes sin pterigión ni pinguécula u otras degeneraciones conjuntivales previamente a la cirugía de las cataratas. La edad media fue de 69.3 ± 7,8 años, de los cuales 19 eran hombres y 16, mujeres. El protocolo del estudio se realizó siguiendo la declaración de Helsinki y fue aprobado por el comité ético de la FOM. El consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes, después de la explicación sobre la naturaleza de la investigación. Tanto las muestras procedentes de pterigión primario y de conjuntiva normal fueron preparadas para ser fijadas para inmunotinción, así como para realizar la técnica de Elisa. Por una parte los segmentos de tejido se sometieron a fijación en formaldehído al 4% fresco y embebidos en parafina. Se realizaron secciones de 3-5 ¿m que fueron teñidas con hematoxilina y eosina (HE). Además las secciones se tiñeron también con anticuerpo Ki-67 (prediluido, Ventana Medical Systems, Inc. Tucson, Arizona, EE. UU.), caspasa-3 (1:50 Thermo, Waltham, EE.UU.), VEGF (1:100, Roche, Basilea, Suiza), PEDF (1:1000 Bioproducts MD Middletown; EE. UU.), GSH (1:50 Abcam, Cambrigde, Reino Unido), SOD (1:100, AbD Serotec, Oxford, Reino Unido), MDA (1:1000, Abcam, Cambrigde, Reino Unido) y HNE (1:200, Alpha Diagnostic International, Cambridge, UK). La tinción se realizó utilizando el Clásico Benchmark Autostainer (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, Arizona, EE.UU.) y se visualizaron utilizando una técnica de peroxidasa estándar (Ultraview universal DAB kit de detección, Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, Arizona, EE.UU.). Las inmunorreacciones positivos de los anticuerpos primarios se detectaron mediante un anticuerpo secundario conjugado con polímero de peroxidada marcado con diaminobencidina (DAB) como cromógeno. La Immunopositividad de las células fue valorada en tres secciones diferentes en cada diapositiva en un test triple ciego. Se estudiaron la concentración de óxido nítrico mediante la reacción de Griess, una forma indirecta de medición que cuantifica los nitratos y nitritos en la muestra. Se trata de una reacción colorimétrica que permite la cuantificación práctica de varias muestras en placas de ELISA utilizando un espectrofotómetro. Para la medida de MDA en homogenados de tejido se utilizó un kit colorimétrico comercial (FR22 by Oxford Biomedical Research; Oxford, MI; EE. UU.). En el análisis estadístico los datos se expresan como media ± desviación estandar. Las comparaciones entre el grupo del pterigión primario y de los controles se realizaron utilizando la prueba t de student y la correlación entre las distintas moléculas analizadas en el pterigión mediante la correlación de Pearson. Las diferencias se establecieron como estadísticamente significativa con p <0,05 nivel. RESULTADOS La proliferación se estudió con el antígeno Ki-67, altamente específico para mostrar células en proliferación. Se observó que el tejido de pterigión presentaba un porcentaje significativamente mayor de células que expresaban el marcador de proliferación Ki-67 respecto al tejido control sano. La razón de células marcadas respecto a totales fue 70,8 ± 5,01 (n =32) en el grupo pterigión frente a 62,9 ± 2,70 (n=35) en el grupo control (p <0.05) Para estudiar la apoptosis se estudió la tinción inmunohistoquimica en las muestras de pterigión y conjuntiva del grupo control. Se hizo un recuento de células que expresaban caspasa-3 en tres campos de tres cortes de parafina de cada espécimen. No se hallaron diferencias significativas en el porcentaje de células que expresaban caspasa-3 entre pterigión y control, siendo la razón de células marcadas respecto a totales 69,9 ± 4,08 (n = 35) en el grupo control frente a 64,9 ± 8,86 (n = 32) en el grupo de estudio. En cuanto a la angiogénesis, el resultado de la inmunotinción para el factor estimulante angiogénico VEGF, mostró que había más células inmunopositivas VEGF con un ratio medio de 54,70± 9,61 (n=32) en las muestras de pterigión que en las muestras de tejido control, 43,02 ± 13,79 (n= 35) células positivas. (p <0.05) Por otra parte, la inmunotinción con el potente inhibidor de la angiogénesis, factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) no mostró diferencias entre pterigión, con un ratio medio de 59,5 ± 5,52 (n = 35) células positivas en las muestras control y 58,9 ± 7,29 (n = 32) en las muestras de pterigión. Iniciamos el estudio del estrés oxidativo midiendo la concentración del oxido nítrico (NO), como agente pro-oxidante. Esta cuantificación se realizó de forma indirecta mediante la medida de su producto inmediato, los nitritos, cuya formación se correlaciona con la concentración intracelular de óxido nítrico. La concentración de nitritos fue 0,65 ± 0,33 ¿mol/mg de proteína en el grupo control (n=35) y 1,32 ± 0,71 ¿mol/mg de proteína en el grupo pterigión (n=32) (p < 0,05). En el estudio de la protección antioxidante se hizo un recuento de las muestras inmunoteñidas de células positivas a GSH en tres campos de tres cortes de cada espécimen, que luego se promedió. En el tejido de pterigión había menos células positivas a GSH (52,8 ± 6,27, n=32) que en el tejido control (60,9 ± 5,72; n=35), siendo esta diferencia estadísticamente muy significativa (p < 0,05). Por otra parte, también como defensa antioxidante, se evidenció que en el tejido de pterigión había más células que expresaban SOD (62,7 ± 6,16; n = 32) respecto al tejido control (69,0 ± 5,43; n= 35), siendo esta diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05). La inmunotinción de la HNE, marcador de peroxidación lipídica, reveló un aumento significativo de inmunotinción HNE-positiva en el tejido de pterigión (75,6 ± 7,5; n = 32) respecto a la conjuntiva sana (66,9 ± 5,2; n = 35) (p <0,05). El recuento de células positivas a MDA indicó que había un aumento en el ratio de células positivas en el tejido de pterigión (62,3 ± 8,25; n = 32) respecto al tejido control (56,5 ± 5,08; n =35), pero no alcanzó la significancia estadística, por lo que se repitió su analisis mediante la técnica de ELISA en homogendados de tejido. En este caso se observó que los homogenados de pterigión contenían significativamente más MDA (0,13 ± 0,12; n = 32) que los homogenados control (0,68 ± 0,35; n =35) (p < 0,05). Cuando se realizaron las correlaciones entre los diferentes grupos, se evidenciaron 6 correlaciones con significancia estadística: entre ellas resultó como correlación negativa la observada entre el MDA y GSH (r = -0,569, p <0,05), así como la correlación entre el MDA y Caspasa-3 (r = ¿0,441, p <0,05). Se obtuvieron correlaciones positivas entre el MDA y SOD (r = 0,528, p <0,05), entre el MDA y HNE (r = 0,461, p <0,05), entre Caspasa-3 y GSH (r = 0,514, p <0,05), y finalmente una correlación positiva muy significativa entre HNE y VEGF en tejidos de pterigión y la conjuntiva (r = 0.794, p <0,05). DISCUSIÓN Se estudió en las muestras de tejido procedente del pterigión y de conjuntiva sana la expresión de varios biomarcadores para la proliferación, apoptosis, la angiogénesis y el estrés oxidativo. La determinación del antigeno Ki-67 mostró mayor número de células teñidas en tejido de pterigión en comparación con las muestras de conjuntiva. Este hallazgo es compatible con estudios anteriores sobre le papel del Ki-67 en el pterigión, y muestra una clara connivencia con los hallazgos clínicos, donde la proliferación en el pterigión es evidente durante su evolución. Otros estudios han demostrada la desregulación del ciclo celular al encontrar alterada la expresión del gen supresor tumoral p53. La tinción de caspasa-3 en tejido de pterigión no encontró un aumento en el tejido de pterigión en comparación con la conjuntiva normal. Este resultado coincide con anteriores hallazgos, donde se evidenció un aumento de los marcadores de proliferación y al mismo tiempo un aumento en el marcador antiapoptótico Bcl-2 y, pero sin aumento de la caspasa-3 en tejido de pterigión. Por lo tanto, parece probable que la apoptosis celular está reducida y que las caspasas no están involucrados en el desarrollo de pterigión, lo que sugiere la implicación de otras vías. El pterigión se compone de un tejido con gran actividad proliferativa y altamente vascularizada, causando la invasión corneal. El factor de crecimiento endotelial vascular VEGF juega un papel fundamental en la regulación del crecimiento vascular. En este estudio se encontró un incremento en la expresión de VEGF en el tejido de pterigión en comparación con tejido de control. Esto concuerda con estudios previos sobre el aumento de la microdensidad vascular junto con la sobreexpresión del VEGF en el pterigión, sugiriendo la implicación patogénica de este factor de crecimiento en el desarrollo del pterigión. Por otra parte, el PEDF se aisló originalmente de un cultivo celular del tejido pigmentario de la retina (RPE) de humano, pero posteriormente se ha informado que también se expresa en otros tejidos distintos. En el ojo, la expresión de PEDF está regulado por hipoxia en una manera opuesta a VEGF. En nuestro estudio también se midió la expresión de PEDF y no se encontraron diferencias en la expresión de PEDF entre pterigión y tejido conjuntiva. Este hallazgo contrasta con una publicación de Jin y colaborades en 2002, en la que se encontró una disminución en la expresión de PEDF en comparación con las muestras control. Sin embargo, en este artículo, los ojos considerados control se obtuvieron a partir de cadáver donante y no se distinguió entre pterigión primario o secundario. El estrés oxidativo también se ha relacionado con el desarrollo del pterigión. Se estudiaron las moléculas oxidantes representadas por la medición indirecta del oxido nítrico, a través de los nitratos intracelulares. El resultado mostró mayor cantidad de nitratos en tejido de pterigión, siendo congruente con un desequilibrio oxidativo. Es conocido que la radiación UV es capaz de producir aumento del NO directamente por fototoxicidad pero también indirectamente mediante la activación de la oxido nítrico sintasa inducible. En la presente estudio también se investigó la expresión de la peroxidación de lípidos marcadores MDA y HNE en el tejido de pterigión y ambos se encuentran aumentadas en comparación con la conjuntiva normal. Además, la defensa antioxidante de GSH se encuentra disminuida en el tejido de pterigión. La SOD, enzima desintoxicante, se encontró aumentada en el tejido de pterigión, que está en contraste con lo que ha sido publicado en un estudio anterior de Balci y colaboradores en 2011. Sin embargo, esta discrepancia puede deberse a que los materiales de estudio fueron realmente diferentes, ya que en nuestro estudio sólo se estudiaron pterigión primario. El aumento de la expresión de SOD observada puede ser debida a que se produce anión superóxido por los neutrófilos activados durante la respuesta inflamatoria y considerando que el pterigión tiene características inflamatorias, el aumento del número de células positivas SOD bien podría ser una respuesta a la inflamación. Resulta reveladora la correlación descubierta entre la HNE y VEGF, ya que se trata de una correlación fuertemente positiva que pone de manifiesto la relación entre estrés oxidativo y angiogénesis Este resultado se ajusta con un resultado anterior en la que se vio como el HNE regulaba la expresión del VEGF en las células del epitelio pigmentario de la retina. En bajos niveles fisiológicos, ROS son indispensables en numerosos procesos bioquímicos, funcionando como mensajeros redox y moléculas importantes en la señalización intracelular. Además de tener un papel importante en la diferenciación celular, la proliferación y la apoptosis, ROS también son actores clave en los procesos inflamatorios y la defensa contra los microorganismos. Sin embargo, a altos niveles, ROS puede oxidar ADN, proteínas, lípidos, hidratos de carbono y, mediando numerosas redox relacionados con condiciones patológicas. El producto oxidativo guanina, 8-oxo-2'-desoxiguanosina (8-oxodG), es uno de los productos modificados por la oxidación más estudiados y se utiliza ampliamente como un biomarcador de estrés oxidativo y la carcinogénesis. ROS tienen una doble función en la biología del tumor y se ha informado de que participan tanto en la progresión del tumor y regresión. Pterigión ha sido descrito como una entidad con características similares a los tumores y se desarrollan a partir de progenitores epiteliales limbales activados. Se puede especular que el desarrollo del pterigión es provocada por la radiación UV que produce ROS y sus derivados (tales como aldehídos reactivos HNE y MDA) en células progenitoras epiteliales limbales. Los aldehídos reactivos como HNE y MDA, por tanto, podrían actuar como segundos mensajeros que a su vez pueden conducir a la regulación de la apoptosis,la proliferación y la angiogénesis tal y como ha sido reportado en el presente estudio. Sin embargo, se hacen necesarios nuevos estudios para valorar el papel de los antioxidantes que podrían limitar el daño producido por la peroxidación lipídica, y así ofrecer un nuevo enfoque terapéutico para esta enfermedad.