Aplicación de la secuenciación masiva de dna al diagnóstico de los defectos congénitos de glicosilación y de glucogenosis

Résumé

Hasta hace unos años, el estudio genético de las enfermedades hereditarias en humanos se realizaba mediante la secuenciación gen a gen por el método de Sanger convencional tras una serie de aproximaciones clínicas, bioquímicas y/o celulares en un intento de reducir a uno o a un conjunto pequeño de genes candidatos a analizar, que se secuenciaban por orden de frecuencia poblacional. Este proceso resultaba lento y especialmente laborioso en enfermedades genéticamente heterogéneas como son los defectos congénitos de glicosilación (CDG), un grupo de defectos genéticos que afectan a las rutas de glicosilación, y la glucogenosis, conjunto de deficiencias en las enzimas implicadas en el metabolismo del glucógeno. En este trabajo presentamos la utilización de la secuenciación masiva (NGS) aplicada al diagnóstico genético de 39 pacientes con sospecha de CDG y 47 de glucogenosis. Se utilizaron tres aproximaciones de captura genética para su evaluación como método de análisis genético. En primer lugar se procedió al diseño de dos paneles para la captura de genes relacionados con cada grupo de enfermedad a estudio (TES). La tasa diagnóstica del panel de CDG fue baja debido a que los CDG son enfermedades emergentes donde nuevos genes son descritos con regularidad. Con el fin de mejorar la tasa diagnóstica y, puesto que ambos grupos de enfermedades debutan con una sintomatología clínica que puede ser solapante a otras patologías, se aplicó una captura del exoma celular completo (WES) y/o la captura del exoma de genes asociados a patología en humanos y anotados en la base de datos OMIM (CES). La tasa diagnóstica fue mayor en estos diseños ya que, al incluir un mayor número de genes, permitieron la búsqueda de variantes en otros genes asociados a la patología del paciente causantes de otras enfermedades conocidas. Además mediante WES se identificaron mutaciones en un gen no vinculado a ninguna enfermedad hasta la fecha. NGS, además de permitir el análisis simultáneo de varios genes, resultó ser más sensible que Sanger ya que evitó allele dropout en dos muestras y permitió detectar una variación en el número de copia. Además, cabe destacar la sensibilidad en la detección de mutaciones identificadas en genes con gran homología de secuencia a otras regiones del genoma. En total hemos llegado al diagnóstico genético de aproximadamente el 50% de los pacientes analizados. En CDG hemos identificado 23 mutaciones, 12 de ellas nuevas, en 13 genes previamente relacionados con la enfermedad. Además, hemos descrito un nuevo gen causante de CDG no vinculado a ninguna patología hasta la fecha. Los estudios funcionales realizados indicaron que la proteína que codifica podría estar implicada en la homeostasis del aparato de Golgi. En glucogenosis hemos identificado 23 mutaciones, 10 nuevas, en 6 genes descritos. Además, hemos identificado un total de seis pacientes que portaban mutaciones en otros genes no asociados a las enfermedades inicialmente sospechadas, genes cuya deficiencia producen un fenotipo y/o un espectro bioquímico solapante. El diagnóstico genético preciso realizado en este trabajo ha permitido iniciar un tratamiento específico en cinco pacientes. En resumen, nuestros resultados demuestran el potencial de la secuenciación masiva aplicada al diagnóstico de enfermedades genéticamente heterogéneas permitiendo, no sólo el correcto asesoramiento genético, sino también la aplicación de tratamientos específicos así como dirigir la investigación hacia terapias basadas en los mecanismos de acción de las mutaciones que se identifican (medicina de precisión).