Viabilidad de células estresadas de Cronobacter sakazakii mediante citometría de flujo y espectrometría de masas

Zusammenfassung

C. sakazakii es una bacteria patógena termotolerante asociada a brotes en recién nacidos alimentados con leche de fórmula infantil en polvo. Estas leches no se almacenan en condiciones estériles, por lo que la contaminación de estos productos sumado a una incorrecta preparación y almacenaje de los mismos puede conducir a la proliferación bacteriana. En un primer trabajo, se abordó el estudio de los estados fisiológicos de las células de C. sakazakii utilizando citometría de flujo con el fin de detectar las células comprometidas, que son aquellas viables pero no cultivables por los métodos de siembra en placa, así como evaluar el impacto de los tratamientos térmicos, habitualmente usados en la preparación de dichas leches, en esas poblaciones. Para ello, se utilizaron suspensiones de bacterias tratadas térmicamente, sin tratar y muertas. Tras tratamientos térmicos a 60 o 65ºC, el número de células comprometidas aumentó como resultado del incremento de células con membranas dañadas, aunque no resultaron efectivas para inactivar la bacteria. De esta forma, se evidencia que los tratamientos térmicos que no llegan a la pasteurización no son suficientes para garantizar la inocuidad de las leches reconstituidas. La citometría de flujo podría ser utilizada para realizar estudios de cribaje con el fin de disminuir el riesgo derivado de la presencia del microorganismo viable pero no cultivable en las leches de fórmula. En un segundo estudio, las células muertas de C. sakazakii se tiñeron doblemente con SYTO9- o con SYBR Green I-PI para determinar su estatus fisiológico a diferentes temperaturas utilizando citometría de flujo. Mientras que las células comprometidas fueron las predominantes a 60 y 65ºC, a 70ºC imperaron las muertas. A temperaturas mayores de 80°C, todos los eventos adquiridos se observaron en la zona de las células muertas. Se realizaron ensayos con distintos volúmenes de cada fluorocromo a 70ºC, desde 0,125 a 1,5 µl, encontrando diferencias estadísticamente significativas entre las tinciones con SYTO9 o con SYBR Green I. Los resultados muestran que el máximo volumen utilizado no es necesario para detectar las células vivas, pero sí lo es para las dañadas completa o parcialmente. La localización de las células comprometidas fue confirmada por separación celular, no detectando cambios en su estatus fisiológico tras un período de refrigeración de 2 h a 4ºC. Las células de C. sakazakii procedentes de una contaminación cruzada o de leches infantiles mal preparadas podrían recuperarse y multiplicarse si hay una demora en su consumo superior a 2 h a temperatura ambiente, constituyendo un riesgo de salud pública. En un tercer trabajo se estudió la respuesta de C. sakazakii al estrés térmico a través de espectrometría de masas basándonos en la expresión de proteínas relacionadas con el estrés y en el perfil peptídico, con el objetivo de identificar biomarcadores implicados en la supervivencia del microorganismo ante condiciones ambientales subletales. Se identificaron 4 marcadores peptídicos en el espectro de masas correspondientes a proteínas intactas. Se identificó y validó un posible marcador de estrés de C. sakazakii en m/z 3336,6. Los resultados mostraron que el choque térmico aplicado al microorganismo aumentó la expresión de chaperones como DnaK, proteínas independientes del ATP involucradas en el correcto plegamiento de proteínas y algunos factores de virulencia relacionados con la integridad de la membrana. Estas proteínas parecen desempeñar un rol relevante en el mantenimiento de la síntesis proteica como mecanismo adaptativo al estrés térmico subletal. El estudio de la resistencia de C. sakazakii a variaciones de temperatura subletales aporta información acerca de su viabilidad y sus estrategias para sobrevivir, como la generación de estados fisiológicos adaptativos o la sobreexpresión de marcadores peptídicos que puedan suponer una vía adicional de patogenicidad.