Clonación y caracterización de genes de proteínas inactivadoras de ribosomas de las especies sambucus ebulus l. Y beta vulgaris subsp. Vulgaris

Zusammenfassung

En este trabajo se aborda la clonación molecular de varias RIPs ("ribosome-inactivating proteins") presentes en Sambucus ebulus L., y Beta vulgaris subsp., vulgaris, utilizando la técnica denominada RACE ("Rapid Amplification of cDNA Ends"). El yezgo (S.ebulus) posee un gran número de RIPs en diversos tejidos, tanto de tipo 1 como de tipo 2. Con este trabajo se ha conseguido la clonación de la ebulina 1, RIP de tipo 2 no tóxica presente en las hojas de la planta. El gen de la ebulina 1 incluye la secuencia de un péptido señal y de un péptido de conexión entre sus dos cadenas constituyentes, que son procesados en la maduración de la proteína. En colaboración con el profesor J.D. Robertus se han obtenido cristales de ebulina 1, lo que la convierte en la primera RIP de tipo 2, junto con la ricina, que ha sido clonada y cristalizada. Ambas proteínas presentan la misma actividad enzimática, por tanto, el cambio observado en el subdominio de fijación de azúcares 2gamma, propio de las proteínas inactivadoras de ribosomas de tipo 2 del género Sambucus, podría estar en la base de su escasa toxicidad que las diferencia de la ricina. A partir de hojas de remolacha azucarea, se han aislado y caracterizado varios clones cDNA codificadores de la proteína betina 27. Su traducción da lugar a la misma proteína pero difieren en la región no cidificadora en 3'. Se han realizado, además, experimentos de deglicosilación química de las betinas 27 y 29 nativas, lo que nos permite afirmar que se trata de una misma proteína con diferente grado de glicosilación. Se ha realizado un intento de expresión preliminar del gen de la betina 27 en Escherichia coli, pero se trata de una RIP altamente tóxica para la bacteria. Se ha realizado un estudio de la inducción de la expresión de las betinas en distintos estadios del desarrollo de la planta sometidos al tratamiento con mediadores de la respuesta antipatogénica que indican que únic