Transcriptomics technologies and their potential for pine pitch canker management

Résumé

El chancro resinoso del pino (PPC, por sus siglas en inglés) es una grave enfermedad que afecta a Pinus spp. y Pseudotsuga menziesii en todo el mundo. La infección por su agente causal, Fusarium circinatum, provoca chancros de resina en los troncos y ramas laterales de los huéspedes maduros, que pueden acabar muriendo por anillamiento o rotura del tronco. En los viveros, los principales síntomas son el puntisecado, marchitamiento y muerte de las plántulas. Sin embargo, el patógeno, de naturaleza hemibiotrófica, puede permanecer endofítico en plántulas de pino sin mostrar síntomas de infección e incluso ser inadvertido en algunas especies herbáceas. Desde el primer registro en 1945 en Norteamérica, se ha notificado la presencia de F. circinatum en 14 países de América, Asia, África y Europa. Varios factores han contribuido a la propagación de la enfermedad a todos estos continentes, siendo el más importante la globalización en lo que respecta al comercio de material vegetal de reproducción. El viento, las gotas de lluvia y los insectos forestales asociados a los pinos contribuyen a la dispersión local del patógeno. A pesar de su importancia, no se dispone de medidas eficaces para erradicar o controlar la enfermedad del PPC ni en los viveros ni en el monte. El objetivo principal de esta tesis doctoral fue esclarecer los mecanismos de regulación eficaces para el control de la enfermedad PPC. Para ello, en primer lugar, se llevó a cabo una recopilación de información actual sobre las vías de propagación del patógeno, proponiendo mecanismos preventivos para evitar su introducción en zonas libres de la enfermedad. Las múltiples vías de propagación hacen de F. circinatum un reto a prevenir, agravado por el reciente descubrimiento de su colonización endofítica de especies no contampladas previamente como hospedantes que ilustra la importancia del conocimiento biológico y ecológico para el diseño de estrategias de intervención eficaces. Además, la erradicación de la enfermedad puede ser factible sólo si se detecta de forma inmediata a su introducción. En este sentido, se necesitan urgentemente nuevos métodos de detección y diagnóstico para la pronta detección de F. circinatum en semillas, plantas e insectos vectores. Para ello, es fundamental la colaboración entre las autoridades fitosanitarias y los investigadores a través de redes interdisciplinarias que permitan aumentar el conocimiento de la enfermedad y sensibilizar a los agentes implicados sobre los riesgos y las medidas de mitigación. En este trabajo también se identificaron los puntos débiles de la normativa actual y se aportaron sugerencias para su aplicación. En segundo lugar, para entender los mecanismos moleculares implicados en la patogenicidad de F. circinatum, su transcriptoma fue explorado utilizando tecnologías de secuenciación masiva. Dicho estudio tenía como objetivo investigar el efecto residual en el transcriptoma de F. circinatum de la pérdida de un micovirus. Nuestros resultados mostraron una ligera aceleración del metabolismo del hospedador, posiblemente debido a la regulación positiva de genes implicados en funciones esenciales para el desarrollo del hongo. Por ello, cobra especial importancia la obtención de líneas isogénicas con y sin infecciones por micovirus para un estudio preciso de las interacciones virus-hongo, evitando aislados alterados que hayan sufrido pérdidas de micovirus o hayan sido sometidos a tratamientos invasivos para eliminarlos. Los métodos de transfección con micovirus de F. circinatum deben ser probados para comprobar la viabilidad del virocontrol de este patógeno forestal. En el tercero de los estudios, se analizó el transcriptoma del patógeno durante la fase inicial de la infección en especies de Pinus spp. con diferentes grados de susceptibilidad. En una especie relativamente resistente (Pinus pinea), los genes de F. circinatum relacionados con la degradación de la pared celular y la lignina fueron predominantemente inducidos. Por el contrario, el patógeno tuvo una absorción activa de nutrientes (como el nitrógeno) durante su infección en la especie altamente susceptible (P. radiata). Esto podría proporcionar a F. circinatum una ventaja competitiva en la interacción planta-patógeno. Por último, se examinaron los mecanismos moleculares de regulación implicados en la defensa del árbol mediante el estudio del transcriptoma de Pinus spp. utilizando la tecnología RNA-Seq. En el tercer estudio, el perfil del transcriptoma de P. pinea cuatro días después de la inoculación de F. circinatum reveló una percepción temprana de la infección del patógeno junto con una fuerte y coordinada activación de la defensa a través del refuerzo y lignificación de la pared celular, la actividad antioxidante, la inducción de genes PR y la biosíntesis de hormonas de defensa. Por el contrario, P. radiata tuvo una respuesta más débil, posiblemente debido a una percepción deficiente de la infección fúngica que condujo a una señalización de defensa menor. Como resultado, se identificaron genes de resistencia a la enfermedad altamente expresados en P. pinea que pueden ser utilizados como indicadores de resistencia en programas de mejora genética. Aunque en este trabajo también se evaluaron los parámetros fisiológicos que subyacen a los fenotipos de huésped susceptible y resistente a PPC, no se encontraron cambios significativos tras la infección del patógeno. En el cuarto estudio, se llevó a cabo un estudio transcriptómico en profundidad de la interacción P. radiata-F. circinatum mediante la identificación de moléculas de ARN no codificantes de cadena larga (ARNlnc) en el huésped y, especificamente, aquellos que responden a la infección del patógeno. El análisis funcional de los genes próximos a estos ARNlnc de respuesta al patógeno sugirió su participación en importantes procesos de defensa, incluyendo la transducción de señales y el refuerzo de la pared celular. Estos resultados presentan un mapa completo de los ARNlnc en P. radiata tras la infección de F. circinatum y proporcionan un punto de partida para entender sus mecanismos de regulación y funciones en la defensa de las coníferas. En general, una comprensión profunda del mecanismo de regulación de los genes contribuirá a la optimización de los programas de mejora genética para una futura comercialización de pinos resistentes, una de las herramientas más prometedoras para la gestión de PPC.